Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren
2.2.2 Enzymatische Modifikation von DNA
2.2.2.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Zur enzymatischen Spaltung von DNA wurde der Restriktionsansatz in einem Volumen von mindestens 20 µl bei der für das Enzym optimalen Temperatur für 1-2 h oder über Nacht inkubiert, wobei pro µg DNA 2-3 U des jeweiligen Enzyms eingesetzt wurden. Für den simultanen Verdau mit zwei Restriktionsendonukleasen wurde ein Puffer eingesetzt, der beiden Enzymen eine ausreichende Aktivität erlaubt. Die Vollständigkeit der Spaltung wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Die Restriktionsendonukleasen wurden vor der Durchführung weiterer enzymatischer Modifikationen hitzeinaktiviert (15 min, 65°C).
2.2.2.2 Auffüllreaktion von DNA-Fragmenten
Durch die Behandlung mit Klenow-Fragment oder Taq-Polymerase mit proof-reading Aktivität wurden 5´-überhängende Enden von DNA-Fragmenten zu stumpfen (blunt ends) aufgefüllt. Die Reaktionen wurden in Volumina von 20 µl durchgeführt, wobei jeweils ca. 1 µg DNA modifiziert werden konnte. Die genauen Bedingungen der Reaktion richteten sich nach den Angaben des Herstellers des verwendeten Enzyms. Wegen der hohen Stabilität des Enzyms mußte die so behandelte DNA mit einer Phenol/Chloroform Extraktion mit anschließender Ethanolfällung oder über Agarosegelelektrophorese mit anschließender Glasmilchelution (2.2.1.8) aufgereinigt werden.
2.2.2.3 Dephosphorylierung von Plasmid-DNA
Um eine Religation linearisierter Plasmid-DNA zu verhindern, wurde, eine Dephosphorylierung durchgeführt. Die endständigen 5´-Phosphatgruppen des Vektors wurden mit hilfe des Enzyms Antartic Phosphatase entfernt. Dazu wurde die DNA mit 2 U Antarctic Phosphatase für 1 h bei 37°C und anschließend zur Hitzeinaktivierung des Enzyms für 15 min bei 65°C inkubiert.
2.2.2.4 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von Vektor-DNA (geschnitten und dephosphoryliert) mit DNA-Fragmenten wurde in dem vom Hersteller angegebenen Puffersystem der T4-Ligase in 10 µl-Ansätzen durchgeführt. Das Enzym T4-DNA-Ligase katalysiert dabei die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphatenden der linearisierten DNA, so dass rekombinante DNA-Moleküle entstehen. In der Regel wurden folgende Mengen für einen Ligationsansatz eingesetzt:
25-50 ng Vektor-DNA 30-120 ng Insert-DNA
1 µl T4-DNA-Ligase (5 U/µl) 1 µl 10x Ligationspuffer ad 10 µl H2O
Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert.
2.2.2.5 Subklonierung von PCR- und RT-PCR-Produkten
Taq- und andere Polymerasen besitzen eine terminale Transferase-Aktivität, die zu einer Addition von einem Nukleotid an das 3´-Ende von PCR-Produkten führt. In Anwesenheit aller vier Nukleotide wird hauptsächlich dA angehängt. Diese terminale Transferase-Aktivität ist die Grundlage für die TA-Klonierungsstrategie. Für die Subklonierung von PCR- und RT-PCR-Produkten wurde das pGEM-T-easy Vektor-System verwendet, bei welchem die Enden des linearisierten Vektors am 5´-Ende T-Überhänge besitzen. Folgende Komponenten wurden für den Ligationsansatz verwendet:
50 ng pGEM-T-easy Vektor
x µl PCR-Produkt (molares Verhältnis Insert:Vektor, 3:1) 1 µl T4-DNA-Ligase 10x Puffer
1 µl T4-DNA-Ligase ad 10 µl H2O
Die Bestandteile wurden gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Produkte einer Ligation wurden anschließend in kompetente E. coli Bakterien transformiert (2.2.2.6).
Die PfuUltra-high-fidelity-Polymerase besitzt keine terminale Transferase-Aktivität, so dass zur Subklonierung der PCR-Produkte in einen pGEM-Teasy Vektor an das 3’-Ende ein dA angehängt werden muss. Folgende Komponenten wurden dabei gemischt und bei 70°C für 30 min inkubiert:
7 µl aufgereinigtes PCR-Produkt 1 µl Platinum-Taq
1 µl 10x Platinum-Puffer + MgCl2
1 µl dATPs (2mM)
Anschließend konnte eine Ligation wie oben beschrieben durchgeführt werden.
2.2.2.6 Transformation kompetenter Zellen mit Plasmid-DNA [Hanahan, 1983]
Für die Transformation wurde zunächst ein 50 µl-Aliquot kompetenter Zellen auf Eis aufgetaut, 5-10 µl des Ligationsansatzes hinzugefügt und für 30 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen einem Hitzeschock bei 42°C für 1 min ausgesetzt und umgehend für 2 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 500 µl SOC-Medium erfolgte eine einstündige Inkubation des Transformationsansatzes bei 37°C unter Schütteln. Zuletzt wurden 50-500 µl der transformierten Zellen auf Agarplatten ausgestrichen, die der Resistenz des transformierten Plasmids entsprechende selektive Agenzien enthielten. Einzelkolonien zeigten sich nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C.
2.2.2.7 Radioaktive Random prime-Markierung von Nukleinsäuren
[Feinberg und Vogelstein, 1983]
Für die radioaktive Markierung von Sonden zur Hybridisierung von Southern Blot-Analyse wurden doppelsträngige DNA-Fragmente (50-150 ng in 46 µl H2O ) für 5 min in einem kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Zu diesen einzelsträngigen Templates wurden 40 µCi (4 µl) [α 32P] dCTP (Amersham) gegeben. Mit diesem Ansatz wurden die an eine Glasmatrix gebundenen Komponenten des RediprimeTM Random labelling Kit II (Amersham Biosciences, Freiburg) gelöst. Der getrocknete RediprimeTM Reaktionsansatz enthält Oligo(dN)9-Primer, Reaktionspuffer, Klenow-DNA Polymerase und nichtmarkierte Nukleotide (dATP, dGTP und dTTP). Anschließend wurde die markierte DNA mit Hilfe einer MicroSpin S-200HR Säule (Amersham), den Herstellerangaben folgend, von nicht eingebautem [α 32P] dCTP befreit.
2.2.2.8 Radioaktive Endmarkierung von Oligonukleotiden
Für den Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) wurden Oligonukleotide in Sense- und Antisense-Orientierung hergestellt (Invitrogen, Karlsruhe). Nach der Anlagerung der einzelsträngigen Oligonukleotide werden doppelsträngige Fragmente mit überhängenden
Enden (Guanin) erhalten. Für das Anlagern wurden die komplementären Oligonukleotide zusammengegeben und 5 min im kochenden Wasserbad denaturiert. Der Ansatz wurde langsam bis auf RT abgekühlt.
12,5 µl 100 µM Oligonukleotid in Sense 12,5 µl 100 µM Oligonukleotidin Antisense 5 µl 10x Oligonucleotid Annealing Buffer 20 µl DEPC-H2O
Das Markieren erfolgte mit Klenow-Polymerase unter Verwendung von [α 32P] dCTP.
Folgende Komponenten wurden dabei gemischt und bei 37°C für 1 h inkubiert:
1,6 µl dopplesträngige Oligonukleotide (2,5 µM) 2 µl 10x Klenow Puffer
5 µl dNTP ohne dCTP (je 0,5 mM) 1 µl [α 32P] dCTP
1 µl Klenow- Ploymerase ad 20 µl Nuklease- freies H2O
Die Reaktion wurde unter Zugabe von 1 µl 0,5 mM EDTA gestoppt. Anschließend wurde die Probe mit Nuklease-freiem H2O auf 100 µl aufgefüllt und durch Auftragen auf eine MicroSpin S-200HR Säule (Amersham), den Herstellerangaben folgend, von nicht eingebautem [α 32P] dCTP befreit. Die Aktivität in 1-5 µl der gelösten Sonde wurde im Szintillationszähler (Canberra/Packard, Dreieich) gemessen. Das ca. 105 Zerfallsereignisse/min entsprechende Volumen wurde in einem Polyacrylamidgel auf seine Integrität geprüft, indem eine einzelne Bande auf einem geschwärzten Röntgenfilm nachgewiesen wurde.
2.2.2.9 DNaseI-Behandlung
Nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus Gewebe wurde diese einer DNAseI- Behandlung (1U/1µg-RNA) unterzogen, um die Gefahr von DNA-Kontamination in einer folgenden RT-PCR zu vermeiden. Die Komponenten wurden 1 h bei 37°C inkubiert und danach wurde die DNAse I für15 min bei 70 °C inaktiviert.
2.2.3 Gelelektrophorese
2.2.3.1 Gelelektrophorese von DNA
Testgele zur Kontrolle von Restriktionsanalysen, Gele für Restriktionskartierungen oder für Insertisolierungen wurden in Gelkammern gegossen. Je nach Größe der zu trennenden Fragmente wurde 0,5 bis 3% (w/v) Agarose zugesetzt. Je nach Anwendung wurde 1x Turbo- oder 1x TAE- (für Insertisolierungen) Puffer eingesetzt. Nach dem Lösen der Agarose durch mehrmaliges kurzes Aufkochen des Ansatzes wurde die Lösung auf RT abgekühlt. Kurz vor dem Gießen des Gels wurde Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,1 µg/ml zugesetzt. Die Größenbestimmung der DNA-Fragmente erfolgte über den Vergleich mit einem geeigneten Längenstandard. Die Proben wurden vor dem Einfüllen in die Taschen des Gels mit ca. 20% Stop-Mix beschwert. Die Elektrophorese erfolgte anschließend bei konstanter Spannung von 50-150 V.
2.2.3.2 Native Polyacrylamid-Gelelekrophorese
Die Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde zur Darstellung von Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (2.2.7) verwendet. Es wurden 6%ige Gele in den folgenden Komponenten zwischen zwei Glasplatten (20 x 20 x 0,15 mm) einer vorbereiteten Gelapparatur (Fa. PHASE, Lübeck) gegossen:
7,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 40% (19:1) 10 ml 5x TBE
50 µl 10% APS 50 µl TEMED ad 50 ml H2O