Quantitative real time-PCR

Real time-PCR bezeichnet ein PCR-Verfahren, bei dem während der PCR die Menge der entstandenen Produkte in Echtzeit gemessen wird. Die Messung der Produktzunahme geschieht anhand von Fluoreszenzlicht, welches in Abhängigkeit von der Produktmenge emittiert wird. Eine Möglichkeit zur Generierung produktabhängiger Fluoreszenz bieten dsDNA bindende Fluoreszenzfarbstoffe. Hier wurde der Cyaninfarbstoff SYBR-Green I [Jin et al., 1994; Singer et al., 1994], welcher als QuantiTect SYBR-Green PCR Master Mix von der Firma Qiagen (Hilden) vertrieben wird, verwendet. Der Farbstoff bindet weitgehend sequenzunspezifisch in der kleinen Furche doppelsträngiger DNA, mit einer etwa 100fach höheren Affinität als Ethidiumbromid. Das derart gebundene SYBR-Green fluoresziert nach

Anregung etwa 1000x stärker als der freie Farbstoff, weshalb SYBR-Green sehr gut geeignet ist, die Akkumulation doppelsträngiger PCR-Produkte sichtbar zu machen [Morrison et al., 1998]. SYBR-Green lässt sich in Gegenwart von doppelsträngiger DNA mit Blaulicht (480 nm) anregen und zeigt ein Emissionsspektrum mit einem Maximum bei 520 nm (Abb.2.1).

Abb. 2.1: Struktur und Eigenschaften von SYBR-Green I [Wilhelm, 2003].

A. Struktur von SYBR-Green I. B. Generierung von Fluoreszenzsignalen während der PCR durch SYBR-Green.

Das Anregungslicht wird von frei in Lösung befindlichem SYBR-Green nicht absorbiert. Nur der in der kleinen Furche der dsDNA gebundene Farbstoff fluoresziert nach Anregung. C. Absorptions-/Emissionsspektren von SYBR-Green I. Zum Vergleich ist das Emissionsspektrum von Ethidiumbromid nach Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 320 nm unter sonst gleichen Bedingungen gezeigt.

Die Analyse wurde im 384-Well Maßstab mit dem „ABI Prism 7900T Sequence Detection System" durchgeführt. Dieses System arbeitet mit einem Temperatur-Cycler und einem Laser, der zu jedem der 384 Reaktionsansätze gelenkt wird und diese anregt. Über ein ladungsempfindliches Detektionssystem erfolgte die Messung der Fluoreszenz jeder Probe, die durch an dsDNA gebundenes SYBR-Green emittiert wird. Die Daten wurden mithilfe der Sequenz-Detektionssystem-Software (SDS Version 2.1, PE Applied Biosystems) quantifiziert, exportiert und in Excel (Microsoft) ausgewertet. Die Reaktions-Ansätze enthielten je 0,25 µM der Oligonukleotide und 5 µl 2x QuantiTect™ SYBR^®-Green PCR-Master-Mix (Qiagen, Hilden). Letzterer enthält die HotStarTaq™ DNA-Polymerase in einem optimierten Puffer, dNTP-Mix (mit dUTP-Additiv), den SYBR^®-Green I Fluoreszenz-Farbstoff und ROX-Fluoreszenz-Farbstoff als passive Referenz. Der ROX-Fluoreszenz-Farbstoff soll die Korrektur

minimaler Abweichungen erlauben, die durch Pipettierungenauigkeiten oder Fluoreszenz-Schwankungen entstehen können.

Jedem Ansatz wurden 25 ng genomische DNA zugefügt (Endkonzentration 2,5 ng/µl). Für die Erstellung einer Standardkurve wurden Ansätze mitgeführt, die entweder genomische DNA einer klinisch unauffälligen Kontroll-Person oder einer transgenen Maus der F1-Generation in den Endkonzentrationen 5,0 ng/µl, 2,5 ng/µl, 1,25 ng/µl und 0,625 ng/µl enthielten. Um das Auftreten von unspezifischen Produkten auszuschließen, wurde nach Abschluss der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dabei wurde kontinuierlich die Fluoreszenz (F) bei steigender Temperatur (T) gemessen und die Steigung dF/dT (1. Ableitung) errechnet. Diese wurde gegen die Temperatur aufgetragen und damit die Maxima bei den primerspezifischen Schmelztemperaturen aufgezeigt. Zusätzliche Maxima verrieten unspezifische Produkte, z.B. Primer-Dimere. Folgendes Programm wurde für alle Primer verwendet:

50°C 2 min

95°C 15 min Vordenaturierung

94°C 15 s Denaturierung

58°C 30 s 35 Zyklen Annealing

72°C 1 min Elongation

95°C 15 s

60°C 15 s

60°C-95°C 2°C/min Schmelzkurve

Die relative Quantifizierung der initialen Kopienzahl erfolgt bei der real time-PCR anhand des Verhältnisses der Kopienzahl des zu untersuchenden Zielamplikons und eines Referenzamplikons, das unter identischen Bedingungen amplifiziert wird. Bei der Auswertung wird ein Signal-Schwellenwert definiert, bei welchem sich jede Einzelreaktion in der exponentiellen Phase befinden sollte. Der Zeitpunkt (in Zyklen), zu dem das Signal diesen Schwellenwert erreicht, wird als Schwellenwertzyklus oder CT-Wert (threshold cycle) genannt. Dieser CT-Wert korreliert mit der Anzahl der Kopien, die für die Reaktion eingesetzt wurden. Wie in Abbildung 2.2 gezeigt, resultiert eine höhere oder niedrigere Start-Kopienzahl in einem signifikant früheren oder späteren Anstieg der Fluoreszenz-Emission.

Abb. 2.2: Zunahme der Fluoreszenz zweier Proben (A und B) in Abhängigkeit von der PCR-Zyklus-Anzahl. Probe A enthält eine größere Menge an Start-Kopien als Probe B und überschreitet den Schwellenwert daher bei einem früheren Zyklus als Probe A. CT: Schwellenwertzyklus. Quelle: QuantiTect SYBR-Green PCR Handbook, Qiagen (2003).

Aus den Daten der Standardkurven für jedes Amplikon interpoliert das Programm SDS 2.1 die theoretisch eingesetzte DNA-Menge für Referenzamplikon und Testamplikon jeder Probe (entweder Patienten-DNA oder Maus-DNA). Da man für das Testamplikon und das Referenzamplikon einer Probe exakt gleiche DNA-Mengen für die Taqman-Analyse einsetzt, sollte das Verhältnis der durch das Programm interpolierten DNA-Menge von Testamplikon zu Referenzamplikon den Wert 1 ergeben. Im Falle einer Deletion des Bereiches, in dem das Testamplikon liegt, befindet sich nur halbsoviel Template-DNA für das Testamplikon wie für das Referenzamplikon in den Taqman-Ansätzen. Bei der Berechnung des Verhältnisses Testamplikon zu Referenzamplikon erhält man in diesem Fall einen Wert von ca. 0,5. Diese Berechnung wurde zur Auswertung der Ergebnisse für alle Amplikons jedes Patienten in Excel durchgeführt. Um zu bestimmen, wie viele Kopien/Integrationen des transgenen Konstruktes nach der Mikroinjektion in den Pronukleus tatsächlich in das Genom der transgenen Mäuse eingebaut wurden, wurde eine real time-PCR mit einem etablierten Standard und der genomischen DNA der transgenen Mäuse durchgeführt. Da die

Integrationszahl des Standards (genomische DNA von 129/Sv-Mäusen) bekannt ist (1 Kopie), kann man von den dabei erhaltenen Ergebnissen Rückschlüsse auf die noch unbekannte Integrationszahl der transgenen Mäuse ziehen. Die Genotypisierung der transgenen Mäuse wurde mittels relativer Quantifizierung durchgeführt. Für die Erstellung einer Standardkurve wurde eine transgene Maus der F1-Generation verwendet. Im Falle einer homozygoten transgenen Maus befindet sich doppelt soviel Template-DNA für das Testamplikon wie im Vergleich für das Referenzamplikon in den Taqman-Ansätzen. Bei der Berechnung des Verhältnisses von Testamplikon zu Referenzamplikon erhält man in diesem Fall einen Wert von ca. 2. Diese Berechnung wurde zur Auswertung der Ergebnisse für alle Amplikons jeder transgenen Maus in Excel durchgeführt.