Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)

Repräsentieren cDNAs lediglich ein Fragment der entsprechenden mRNA-Sequenzen, ermög-licht die Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) den Erhalt der vollständigen Nuklein-säuresequenz durch eine Amplifikation zwischen der bekannten Region und dem 3´- oder 5´-Ende der mRNA (FROHMAN et al. 1988). In dieser PCR, die je nach zu amplifizierendem Ende als 3´- oder 5´-RACE bezeichnet wird, kommen ein aus der bekannten Sequenzregion hergeleiteter genspezifischer Primer sowie ein universeller Primer zum Einsatz. Dieser

hybri-disiert mit dem zu amplifizierenden Ende, so dass die unbekannte Sequenz am 3´- bzw. 5´-Ende der cDNA durch eine Sequenzierung erkannt werden kann.

Abb. 9: Schematische Darstellung der RACE

Bei dem in dieser Arbeit verwendeten SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (BD CLONTECH) werden die Bindungsstellen für zwei universelle Primer (Universelles Primer A Mix, UPM) durch den Einsatz verschiedener Oligonukleotide (s. Abb. 10) generiert. Dies geschieht im Zuge einer reversen Transkription und sich anschließender PCR.

In der 5´-RACE erfolgt die reverse Transkription mittels eines Oligo(dT)-Primers, dem so genannten 5´-RACE cDNA Synthesis (CDS) Primer. Dieser bindet an die am 3´-Ende fast aller eukaryontischen mRNAs vorliegende homopolymere Poly-A-Sequenz. Die Synthese des 5´-Endes der Erststrang-cDNA beruht auf dem unter 3.7.3.1 beschriebenen Template Swit-ching der MMLV-RT, wobei die komplementäre Sequenz des SMART™ II A Oligonukleo-tid, welche als Primerbindungsstelle fungiert, der entstandenen Erststrang-cDNA angefügt wird. Erfolgt jedoch ein unerwünschtes Priming durch das SMART™ II A Oligonukleotid, besitzen die entstehenden cDNA-Moleküle diese Sequenz an beiden Enden, was eine Hinter-grund-Amplifikation in der 5´-RACE zur Folge hätte. Aus diesem Grund wird die 5´-RACE als Suppression PCR durchgeführt (s. Abb. 8). Die erforderlichen inverted repeats an den Enden der cDNA werden durch eine Step-out PCR generiert, in welcher ein Mix aus zwei Primern die Inkorporation dieser zusätzlichen Sequenzen bedingt. Ein Primer beinhaltet diese Sequenz als einen nicht hybridisierenden Überhang, welcher den Enden des Templates in den

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ersten Zyklen der PCR hinzugefügt wird (MATZ et al. 1999). In den folgenden PCR-Zyklen dient ein zweiter, zu der Überhangssequenz komplementärer, kürzerer Primer als Startsequenz für die Polymerase. Dieser zweite Primer liegt in einer viel höheren Konzentration im Pri-mermix vor. Daher tritt im Zuge dieser Step-out PCR, bedingt durch die Länge der inverted repeats, bei SMART™ II A Oligonukleotid-geprimten Sequenzen ein Suppressionseffekt ein.

So erfolgt bei der Verwendung des UPM und GSP rev eine exponentielle Amplifikation nur der cDNA-Moleküle, die am 5´-Ende von der komplementären SMART-Sequenz und am 3´-Ende von der Oligo(dT)-Sequenz flankiert sind.

Die Poly-A-Sequenz der mRNA wird in der 3´-RACE insofern genutzt, als dass in der rever-sen Transkription zur Erststrang-cDNA-Synthese ein modifizierter Oligo(dT)-cDNA Synthe-sis (CDS) Primer Verwendung findet, an dessen 5´-Ende eine Adaptersequenz angehängt ist, die dem SMART™ II A Oligonukleotid entspricht. Die Vervielfältigung des 3´-Endes ge-schieht in der darauf folgenden PCR durch den Einsatz des UPM und GSP for.

Die Amplifikation des unbekannten 3´- und 5´-Endes erfolgte durch eine Touchdown PCR (DON et al. 1991), in welcher die Annealingtemperatur schrittweise gesenkt wird. Diese ist in den ersten PCR-Zyklen höher als die Schmelztemperatur der universellen Primer, wodurch nur eine Elongation der GSPs erfolgt. Nach dieser Anreicherung an genspezifischem Ampli-fikationsprodukt wird die Annealingtemperatur soweit reduziert, dass die universellen Primer ebenfalls hybridisieren können und eine exponentielle Amplifikation des genspezifischen 3´- oder 5´-Endes möglich ist.

SMART™ II A Oligonukleotid: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3´

3´-RACE CDS Primer : 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3´

(N = A, C, G oder T; N-1 = A, C oder G) 5´-RACE CDS Primer: 5´- T₍₂₅₎N_-1N-3´

(N = A, C, G oder T; N_-1 = A, C oder G)

UPM: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3´ (0,4 μM) 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3´ (2 μM)

Abb. 10: In der RACE verwendete Oligonukleotide (BD CLONTECH)

Für die Durchführung der RACE, die, soweit nicht anders vermerkt, nach Anleitung des Her-stellerprotokolls erfolgte, wurde zunächst wie unter 3.7.1 beschrieben, mRNA aus den Hypo-biose induzierten und nicht induzierten D. viviparus-Larven isoliert (Isolierung 3, s. 4.2). In die Erststrang-cDNA-Synthese für die 3´- bzw. 5´-RACE gingen je 285 ng mRNA der L3ni und 643 ng mRNA der L3i ein. Die Touchdown PCR, in der die entsprechende L3ni- bzw.

L3i-Erststrang-cDNA als Template diente, lief bei dem unter 3.13.2 aufgeführten Tempera-turprofil mit 35 Zyklen im dritten Reaktionsschritt ab. Anschließend wurden die Amplifikati-onsprodukte im Agarosegel visualisiert.

Da sich insbesondere das 5´-Ende bei einigen cDNA-Fragmenten zunächst nicht darstellen ließ, wurde für die 5´-RACE eine erneute Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung des entsprechenden reversen Primers kombiniert mit dem jeweiligen 5´-Primer (s. 9.1) anstelle des 5´-RACE CDS Primers durchgeführt, um somit gezielt nur genspezifische oder verwandte mRNA-Moleküle revers zu transkribieren. Dabei wurde für jeden dieser Klone eine separate Reaktion angesetzt, in welcher je 1696 ng L3ni-mRNA bzw. 463 ng L3i-mRNA aus Isolie-rung 4 (s. 4.2) eingesetzt wurden, das weitere Vorgehen erfolgte wie oben beschrieben. Zu-dem wurde ein drittes Mal Erststrang-cDNA für die 5´-RACE nach Herstellerprotokoll syn-thetisiert, wobei 1408 ng L3ni-mRNA und 1216 ng L3i-mRNA (Isolierung 5, s. 4.2) in die Reaktion eingingen.

Je differentiell transkribiertem Genfragment wurden ein bis fünf Banden der 3´- respektive 5´-RACE kloniert, jeweils drei Kolonien angezüchtet und einer Plasmidpräparation unterzogen.

Es folgte die Sequenzierung eines oder mehrerer Klone pro Bande in beide Richtungen (s.

3.7.8 bis 3.7.10). In den übermittelten Sequenzen wurden die GSP- und UPM-Sequenzen auf-gesucht und letztere von der Sequenz entfernt. Anschließend wurden die RACE-Sequenzen mittels Alignment auf Überlappungsbereiche mit der bereits bekannten cDNA-Sequenzregion überprüft. Anhand dieser überlappenden Sequenzabschnitte konnte das cDNA-Fragment in 3´- bzw. 5´-Richtung verlängert werden. Der Identitätsvergleich mit publizierten Sequenzen sowie konservierten Domänen erfolgte mittels BLASTN, BLASTP und RPSBLAST (NCBI), wobei auf Aminosäureebene neben der Gesamtsequenz auch die Sequenz ab dem ersten Methionin, dem potentiellen Startcodon, in den BLAST einging.

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