qPCR mit TaqMan™-Sonden

Die TaqMan™-Sonden sowie dazugehörige Primer für die Gensequenzen der L3ni 69/92 (SOD), L3i 82/101 (PNMT) und EF-1α wurden mit dem Softwareprogramm Beacon Designer (PREMIER BIOSOFT) ausgewählt. Die Synthese dieser Oligonukleotide wurde sowohl bei der Firma APPLIED BIOSYSTEMS als auch QIAGEN OPERON in Auftrag gegeben. Als Quencherfarbstoff am 3´-Ende der Sonden diente stets TAMRA, als Reporterfarbstoff am 5´-Ende wurde für die EF-1α-Sonde zunächst HEX gewählt, um eine Multiplex-PCR mit der FAM-markierten Sonde für die L3ni 69/92 bzw. L3i 82/101 zu ermöglichen. Die Verwendung dieses Fluoreszenzfarbstoffs erwies sich jedoch als ungeeignet für eine zuverlässige Detekti-on, so dass im weiteren Verlauf der Arbeit eine ebenfalls FAM-markierte EF-1α-Sonde ver-wendet wurde.

Bezeichnung Sequenz (5´ → 3´) T_m

Primer SOD for ATT ACA CTC AAT GGT TAT CAC AGT 55 °C Primer SOD rev GCC CAA TTC CAA GCG TTT AG 55,8 °C Sonde SOD 6-FAM-TAG ACG ATA CCG ATG ACT CCA CAC GC- TAMRA 65,2 °C Primer PNMT for AAT GAT ATT AAC GCA GGA AGG AA 54,8 °C Primer PNMT rev TGC AGC AAT ATT CTA CAC AAA AG 54,6 °C Sonde PNMT 6-FAM- TGT GACAAC GGT ATC AAA CAT CCC TTG G- TAMRA 65 °C Primer EF-1α for CGA CTG GTC ATC TCA TCT ACA 54,9 °C Primer EF-1α rev TCT AAT ACC CAT GCG TAC TTG A 55,2 °C Sonde EF-1α- 6-FAM-ACC CTT ACC CAT CTC TTG TGC TTC CTT-TAMRA 65,1 °C Abb. 13: In der qPCR verwendete Primer und TaqMan™-Sonden (Tm errechnet von

der Primerdesign-Software)

Material und Methoden 117

Bevor mit der quantitativen Untersuchung begonnen wurde, erfolgte eine Optimierung der qPCR. Hierzu wurde mittels konventioneller PCR durch Anlegen eines Gradienten von 56 °C bis 61 °C (MJ Research Multicycler PTC 200, BIOZYM) die optimale Annealingtemperatur der drei Primerkombinationen analysiert. Des Weiteren wurden im MX 4000™ Multiplex Quantitative PCR System (STRATAGENE) verschiedene Endkonzentration der Sonden (200 nM bis 500 nM) und Primer (25 nM Vorwärts- und 300 nM Rückwärtsprimer sowie beide Primer 300 nM) sowie Annealingtemperaturen (52 °C bis 56 °C) getestet.

In der qPCR wurden, jeweils als Duplikate, die Verdünnungsreihen der Plasmide (10⁷ bis 10⁰ Kopien/Ansatz) als 25 ul-Reaktionen (Komponentenzusammensetzung s. 3.15.6) eingesetzt.

Die Messung der Fluoreszenz erfolgte jeweils in der kombinierten Annealing- und Extensi-onsphase der unten aufgeführten two-step PCR.

Aktivierung der Polymerase 95 °C, 10 Minuten Denaturierung 94 °C, 20 Sekunden 40x

Primerannealing und -extension 52 °C, 1 Minute

3.15.6 qPCR mit TaqMan™-MGB-Sonden

Da sich die qPCR mit TaqMan™-Sonden als schlecht reproduzierbar herausstellte, wurden zur weiteren Durchführung TaqMan-MGB-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff am 5´-Ende der Sonden diente FAM. Am 3´-5´-Ende der Sonden befand sich neben einem nicht fluo-reszierenden Quencher (NFQ) respektive dark Quencher auch der MGB. Das Design dieser Sonden und der zugehörigen Primer erfolgte mit dem Softwareprogramm Primer Express™

der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Die Synthese der Sonden wurde bei APPLIED BIO-SYSTEMS in Auftrag gegeben, die Primersynthese erfolgte bei der Firma INVITROGEN.

Bezeichnung Sequenz (5´ → 3´) T_m Primer SOD-MGB for TGG ACG AGC CGT TGT CAT T 59 °C Primer SOD-MGB rev TTA GGC CTT GGC AGA TCG G 60 °C Sonde SOD-MGB 6-FAM-ATG CCG ATG CAG ATG A-MGBNFQ 69 °C Primer PNMT-MGB for CCA CAA AAT CGC CAA GAG CTA 59 °C Primer PNMT-MGB rev TTC GAG TTT TGA TTG GTC CCA 59 °C Sonde PNMT-MGB 6-FAM-TGC GGT GGT ATG AGG GA-MGBNFQ 70 °C Primer EF-1α-MGB for GGT GGG ATT GAC AAA AGA ACC A 60 °C Primer EF-1α-MGB rev CAA GAG ATG GGT AAG GGT TCT TTC 58 °C Sonde EF-1α-MGB 6-FAM-TGA AAA ATT TGA GAA GGA AGC-MGBNFQ 69 °C Abb. 14: In der qPCR verwendete Primer und TaqMan™-MGB-Sonden (Tm

errech-net von der Primerdesign-Software)

Die zu untersuchenden L3ni- und L3i-cDNAs, Plasmid-Verdünnungsreihen sowie Negativ-kontrollen wurden jeweils als Duplikate eingesetzt. In den einzelnen Läufen wurden die Transkriptionsraten des EF-1α in Verbindung mit der L3ni 69/92 oder L3i 82/101 bzw. bei-den Sequenzen in bei-den jeweiligen L3ni- und L3i-cDNAs analysiert. Diese Transkriptionsraten wurden in je fünf verschiedenen Erststrang-cDNAs der L3ni und L3i überprüft. Dabei wurden die Erststrang-cDNAs in den einzelnen Läufen sowohl unverdünnt, 10fach und 100fach ver-dünnt als Matrize eingesetzt. In den qPCRs wurden Primer und Sonde in einer Endkonzentra-tion von je 300 nM, der Referenzfarbstoff ROX in einer EndkonzentraEndkonzentra-tion von 25 nM einge-setzt. Die Stocklösung des Referenzfarbstoffs (1 mM) wurde durch die Zugabe von 179 μl Ampuwa™ und 20 μl 10x Core PCR Puffer zu 1 μl ROX zunächst auf eine Konzentration von 5 μM verdünnt. Die 25 μl-Reaktionsansätze enthielten folgende Komponenten:

2,5 μl 10x Core PCR Puffer 1 μl dNTP Mix (je 5 mM) 2,78 μl MgCl2 (50 mM)

0,75 μl Vorwärtsprimer (10 μM) 0,75 μl Rückwärtsprimer (10 μM) 0,15 μl Sonde (50 μM)

0,38 μl Referenzfarbstoff ROX (5 μM)

0,13 μl SureStart™ Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 1 μl Erststrang-cDNA

Material und Methoden 119

Um Pippetierungenauigkeiten bei den Duplikaten weitestgehend zu vermeiden, wurden zu-nächst mittels einer automatischen Mehrkanalpipette (Matrix Impact2™, APOGENT DIS-COVERIES) 52,8 μl Mastermix mit 2,2 μl Template vermischt und davon je 25 μl in ein se-parates Reaktionsgefäß gegeben. Bevor die Ansätze in das Gerät verbracht wurden, erfolgte eine kurze Zentrifugation, um die durch den Deckel der Reaktionsgefäße verlaufende Fluo-reszenzmessung, die jeweils in der Annealingphase der Reaktion stattfand, nicht durch anhaf-tende Mikrotröpfchen zu beeinträchtigen. Das von dem Softwareprogramm Primer Express™

(APPLIED BIOSYSTEMS) angegebene Temperaturprofil fand Anwendung, allerdings wurde die Annealingzeit von 20 Sekunden auf 24 Sekunden verlängert.

Aktivierung der Polymerase 95 °C, 10 Minuten Denaturierung 94 °C, 20 Sekunden 40x Primerannealing 55 °C, 24 Sekunden Primerextension 72 °C, 30 Sekunden

Die Analyse der qPCR erfolgte mittels der normalisierten, Baseline-korrigierten Fluoreszenz (dRn), wobei die Optionen „adaptive baseline“ und „treat individually“ angewendet wurden.

Dabei fand eine absolute Quantifizierung der L3ni 69/92-, L3i 82/101- und EF-1α-Kopienzahlen anhand der eingesetzten Standardreihen statt. Mit den jeweils ermittelten Ko-pienzahlen konnte berechnet werden, wie viele L3ni 69/92- bzw. L3i 82/101-Kopien auf eine EF-1α-Kopie entfallen. Auch erfolgte für die einzelnen Proben eine Auswertung der Cycle threshold (Ct)-Werte, welche der relativen Quantifizierung dienen sollten. Bei dieser Quanti-fizierungsmethode werden die jeweilige Templatemengen in Relation zu einem Kalibrator (cb) gesetzt. Dieser wird beispielsweise im Fall der L3ni 69/92 vom Ct-Mittelwert der einzel-nen Läufe unter Verwendung eines der L3ni-Templates repräsentiert. Die jeweiligen sich mit den übrigen L3ni- sowie L3i-Templates ergebenden Ct-Mittelwerte werden auf diesen Ka-librator bezogen, wodurch eine relative Erhöhung bzw. Senkung der Transkriptionsrate ermit-telt werden kann. Diese Berechnungen erfolgen nach der Normalisierung auf eine endogene Referenzsequenz (EF-1α) nach folgender Formel:

2^−∆∆Ct

Dabei gilt: ∆Ct = Ct L3ni 69/92 bzw. L3i 82/101− Ct _EF-1α ∆∆Ct = ∆Ct L3ni 69/92 bzw. L3i 82/101− ∆Ct _cb

Voraussetzung für die relative Quantifizierung ist jedoch eine annähernd gleiche PCR-Effizienz der Ziel- und Referenzsequenz. Hierzu erfolgte für die jeweiligen Standardreihen eine Berechnung der ∆Ct-Werte der einzelnen Verdünnungsstufen. Bei der graphischen Dar-stellung der ∆Ct-Werte einer Verdünnungsstufe überschreitet die Steigung der angelegten Geraden im Falle einer äqualen PCR-Effizienz nicht den Wert von 0,1.

Die statistische Auswertung der qPCR Ergebnisse wurde mit dem Computerprogramm SigmaStat Version 2.0 (JANDEL SCIENTIFIC, San Rafael, USA) durchgeführt. Im An-schluss an die Überprüfung auf Normalverteilung mit Kolmogorov-Smirnov erfolgte die Be-rechnung eventueller signifikanter Korrelationen unter Verwendung des t-Tests respektive des Mann-Whitney Rank Sum Tests.