Charakterisierung ausgewählter differentiell transkribierter Genfragmente .1 Überprüfung der genspezifischen Primer

Die insgesamt 19 verifiziert differentiell transkribierten Genfragmente der subtrahierten cDNA-Banken, welche beim Sequenzidentitätsvergleich mittels BLAST signifikante Über-einstimmungen aufwiesen, sollten mit Hilfe der Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) vervollständigt werden.

Zuvor erfolgte eine Überprüfung der ausgewählten genspezifischen Primerpaare. Hierbei konnte mit den zwei Primerpaaren für den Klon L3ni 54 trotz wiederholter Versuche kein PCR-Produkt dargestellt werden. Dies könnte durch die Auswahl suboptimaler Primer respek-tive einer ungeeigneten Primerkombinationen bedingt sein. Weiterhin ist in Betracht zu zie-hen, dass es sich bei dem L3ni 54-Fragment um eine Kontamination der in der SSH verwen-deten L3ni-cDNA handelt oder die reverse Transkription der L3ni 54 auf Grund eines sehr raren Sequenzaufkommens unzureichend war. Für einen der letztgenannten Punkte als mögli-che Ursamögli-che spricht die schwamögli-che Signalintensität dieses Klons beim Differential Screening und das Ausbleiben von Signalen im Zuge des Southern dot blotting, bei welchem cDNA-Sonden aus frisch isolierter mRNA eingesetzt wurden. Eine Degradation der mRNA, welche der RACE zugrunde lag, ist unwahrscheinlich, da sich dieses Problem nur bei der L3ni 54-Sequenz ergab.

Einige der genspezifischen Primerpaare ergaben bei der gelelektrophoretischen Auftrennung zwei oder drei statt der erwarteten einen Bande. Bei den hieraus erhaltenen Sequenzen waren im Alignment regelmäßig eine oder mehr Sequenzlücken der sonst identischen Basenabfolgen zu beobachten. Dieser Umstand, der des Öfteren auch bei den RACE-Sequenzen festgestellt werden konnte, ist auf ein alternatives Spleißen der mRNAs zurückzuführen, welches in Ka-pitel 5.5.4 diskutiert werden sollen.

5.5.2 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)

Bei der Durchführung der RACE gestaltete sich insbesondere die 5´-RACE als schwierig. So waren wiederholte Versuche nötig, um von allen differentiell transkribierten Genfragmenten

Diskussion 185

ein Amplifikat zu erhalten, welches die jeweils erwartete Mindestlänge überschritt. Als Ursa-chen für diese Problematik sind neben degradierter mRNA vor allem sehr lange Transkripte und stabile Sekundärstrukturen infolge GC-reicher Regionen am 5´-Ende zu nennen, wodurch sowohl die reverse Transkription als auch die nachfolgende Amplifikation beeinträchtigt wer-den (FROHMAN et al. 1988; FROHMAN 1993; MATZ et al. 1999; DAS et al. 2001).

Beim Identitätsvergleich mit den entsprechenden Insert-Sequenzen der Klone waren insbe-sondere verschiedene 3´-RACE-Sequenzen der L3i 33 und L3i 53 kürzer als die Insert-Sequenz. Nach FROHMAN (1993) sind verkürzte 3´-Enden auf ein Annealing des Oligo(dT)-Primers an interne A-reiche Regionen statt an das Poly-A-Ende zurück zu führen. Als Ursa-che für diese Fehlhybridisierung nennt der Autor die relativ niedrige Temperatur und den Primerüberschuss während der reversen Transkription. Diese unvollständigen 3´-Enden kön-nen in manchen Fällen durch das Unterschreiten der erwarteten Fragment-Mindestlänge oder das Fehlen eines Stopcodons in der translatierten Aminosäureabfolge ermittelt werden. Einen weiteren Hinweis liefert das Fehlen des Polyadenylierungssignals (DAS et al. 2001). Bei die-sem Signal handelt es sich um eine hoch konservierte mRNA-Sequenz mit der Basenabfolge 5´-AAUAAA-3, welches bei über 88 % der mRNAs die Voraussetzung für das Anhängen der Adenosin-Nukleotide bildet (WELSH et al. 1990; SCHÄFER 1992). Diese hoch konservierte Sequenz konnte in der vorliegenden Arbeit bei 50 % der Sequenzen (L3ni 16, L3ni 22, L3ni 56, L3ni 69/92 sowie L3i 53, L3i 82/101 und L3i 100) festgestellt werden.

5.5.3 Komplettierung der differentiell transkribierten cDNA-Sequenzen

Mit Hilfe der RACE und SL1-spezifischen PCR konnten die Transkripte L3ni 16, L3ni 22, L3ni 51, L3ni 56, L3ni 69/92 sowie L3i 10, L3i 53, L3i 75, L3i 82/101 und L3i 100 als full-length cDNA-Sequenzen erstellt werden. So beginnen beim Sequenzidentitätsvergleich mit-tels BLASTP die Übereinstimmungen spätestens ab der 31. Aminosäure der jeweiligen homo-logen Proteine. Ferner entspricht deren Länge in etwa den translatierten Aminosäuresequen-zen der differentiellen Gentranskripte. Auch bezüglich der L3i 18/86, welche im BLAST kei-ne signifikanten Homologien aufwies, kann von eikei-ner vollständig vorliegenden cDNA-Sequenz ausgegangen werden.

Im Fall der L3ni 22 bestand das 3´-RACE-Produkt stets aus 447 Nukleotiden, welches nach 193 bp nicht mehr mit der Insert-Sequenz des Klons L3ni 22 übereinstimmte. Wurde die 3´-RACE-Sequenz an das cDNA-Fragment des Klons angefügt, zeigte sich im BLASTP mit dem homologen Protein eine höhere Übereinstimmung über einen zudem längeren Teilbe-reich. Da der translatierte Leserahmen der L3ni 22-Sequenz nun auch ein Stopcodon enthielt, ergab sich ferner eine nahezu identische Länge der Aminosäuresequenz (206 aa) mit der des homologen Proteins (202 aa). Daher konnte davon ausgegangen werden, dass diese mit dem Poly-A-Ende erstellte Sequenz der L3ni 22 den wirklichen Verhältnissen entsprach. Das fal-sche 3´-Ende der Insert-Sequenz beruht vermutlich auf einer Fehlhybridisierung mit nachfol-gender Extension während einer der vielen Amplifikationsreaktionen, die zur Erstellung der subtrahierten cDNA-Banken erforderlich waren.

Es gelang jedoch nicht, alle Genfragmente mittels der RACE und SL1-spezifischen PCR zu komplettieren. So zeigten die L3ni 67-, L3i 88- und L3i 99-Sequenzen beim Sequenzidenti-tätsvergleich auf Aminosäureebene längere Teilidentitäten, wenn statt der Sequenz ab dem ersten Methionin die gesamte translatierte Aminosäuresequenz in den BLASTP einging. Auf Grund dieser erhöhten Identitäten in Verbindung mit jeweiligen Sequenzlänge der entspre-chenden homologen Proteine ist davon auszugehen, dass es nicht gelang, das gesamte 5´-Ende dieser Sequenzen zu ermitteln. Für eine unvollständige Nuklein- und damit Aminosäurese-quenz der L3ni 67, L3i 88 und L3i 99 spricht weiterhin die bestehende SeAminosäurese-quenzübereinstim- Sequenzübereinstim-mung mit den jeweiligen C-terminalen Bereichen der homologen Proteine. Da die mRNA des L3ni 67-Homologs 22 980 Nukleotide umfasst, ist eine Komplettierung dieser Sequenz mit-tels der RACE respektive SL1-spezifischen PCR unwahrscheinlich. Bezüglich der L3i 88-Sequenzen ist anzumerken, dass sich in dem gewählten Leserahmen ein Stopcodon vor der translatierten Aminosäuresequenz befindet. Diese Tatsache spricht gegen ein unvollständiges 5´-Ende. Gemessen an der Länge der homologen Guanylyl-Cyclasen von mindestens 646 Aminosäuren im Gegensatz zu maximal 209 Aminosäuren der verschiedenen L3i 88-Sequenzen, scheint es sich bei dem Stopcodon vermutlich um einen Fehler in der Nukleinsäu-resequenz zu handeln. SAIKI et al. (1988) schätzen die Fehlerwahrscheinlichkeit der Taq-Polymerase pro Nukleotid und Zyklus bei 20 PCR-Zyklen auf 2x 10^-4, FROHMAN et al.

(1988) geben eine Fehlerrate von 0,1 % für die gesamte Amplifikationsreaktion an. Bei dem in dieser Arbeit eingesetzten Mix aus Taq- und proofreading Polymerase ist die

Fehlerwahr-Diskussion 187

scheinlichkeit allerdings um ein Vielfaches geringer. Ferner sind hinsichtlich des Fehlens oder des falschen Einbaus eines Nukleotids Fehler bei der reversen Transkription, Plasmidreplika-tion und Sequenzierung in Betracht zu ziehen.

5.5.4 Transkriptvarianten

Bei der Zusammensetzung der einzelnen cDNA-Fragmente wurden neben differierenden Se-quenzen der RACE auch die sich aus der Überprüfung der genspezifischen Primerpaare erge-benden Sequenzen berücksichtigt. Nach GALAS (2001) existieren von jedem Gen durch al-ternatives Spleißen und der damit einhergehenden Kombination unterschiedlicher Exons min-destens zwei oder drei verschiedene Transkriptvarianten. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit für die differentiell transkribierten Sequenzen L3i 10, L3i 33, L3i 75, L3i 82/101 L3i 88, L3i 18/86/99 und L3i 100 sowie L3ni 56 beobachtet werden. Über das alternative Spleißen erfolgt eine quantitative Regulation der Genexpression, welche durch eine Variabili-tät in den untranslatierten Regionen der mRNA und damit einhergehender veränderter mRNA-Stabilität und Translationseffizienz bedingt ist. Des Weiteren wird durch die Entste-hung von Isoformen die Mannigfaltigkeit der Proteine erhöht und eine Modulation der Prote-infunktion ermöglicht (SMITH et al. 1989). Dabei können die translatierten Proteine, bei-spielsweise durch den Ausschluss bestimmter funktioneller Gruppen, sehr stark in ihrer Funk-tion verändert oder gar inaktiv sein (SMITH et al. 1989; GRAVELEY 2001; MODREK u.

LEE 2002). Dies scheint, bezogen auf die Übereinstimmungen im Sequenzidentitätsvergleich und die Aminosäurelänge der entsprechenden homologen Proteine und Isoformen, insbeson-dere auf die Sequenzen L3i 18/86, L3i 33c und L3i 88-2 zuzutreffen. So besitzt die L3i 88-2 die höchste Übereinstimmung mit einer anderen Guanylyl-Cyclase als die übrigen L3i 88-Isoformen, was auf eine differente Funktion dieser Isoform hindeutet. Die L3i 18/86-Sequenzen wiesen im BLASTP Teilidentitäten zu anderen Proteinen als die L3i 99 auf, wel-che zudem nur in geringem Maße signifikant waren. Mögliwel-cherweise handelt es sich hierbei um einen Verlust der Proteinfunktion. Letzteres kann auch für die Isoform L3i 33c angenom-men werden, welche keine signifikanten Homologien zeigte.

FROHMAN (1993) gibt jedoch zu bedenken, dass durch variierende RACE-Sequenzen unter Umständen cDNA-Fragmente generiert werden können, die in vivo nicht existieren. Daher sollte mit Primern aus den äußersten Endbereichen der cDNAs die Existenz der zusammenge-setzten Sequenzen überprüft werden, was in der vorliegenden Arbeit noch nicht erfolgt ist.

5.5.5 Translation der differentiell transkribierten Sequenzen

Bei der Übersetzung der erhaltenen full-length cDNAs in die jeweilige Aminosäuresequenz wurde bei den Sequenzen L3ni 22, L3i 10a, L3i 18/86, L3i 53 und L3i 100b auf Grund der im BLASTP festgestellten Homologien nicht das erste AUG-Triplett der Nukleinsäuresequenz als Translationsstartpunkt gewählt. Dabei können Abweichungen von der „ersten AUG Re-gel“ verschiedene Ursachen zugrunde liegen. Folgt auf das erste AUG-Triplett nach bis zu 30 Codons ein Terminationscodon, kann die 40 S Untereinheit des Ribosoms an der mRNA ver-bleiben und die Translation an einem späteren AUG-Codon erneut starten (KOZAK 1987c;

LUUKKONEN et al. 1995; KOZAK 1999). An diesem ist die Reinitiation am effizientesten, wenn eine gewisse Entfernung zu dem Terminationscodon des vorherigen Leserahmens besteht (KOZAK 1987c). Dies konnte bei Sequenzen L3ni 22 und L3i 100b festgestellt werden.

Ferner beobachtete KOZAK (1987a), dass die das AUG-Triplett flankierenden Sequenzen dessen Erkennung als Initiationscodon beeinflussen. Den optimalen Kontext für den Start der Translation repräsentiert bei Vertebraten die Konsensus-Sequenz GCCRCCaugG. Befindet sich dabei an Position – 3 ein A respektive G oder an den Positionen – 3 und + 4 ein G, er-folgt die Initiation der Translation, unabhängig von den restlichen in der Konsensus-Sequenz vorliegenden Nukleotiden, nahezu immer an diesem AUG-Codon, da es sich hier um die wichtigsten Positionen der Konsensus-Sequenz handelt (KOZAK 1986b; KOZAK 1987b).

Liegt beim ersten AUG-Triplett ein suboptimaler Kontext vor, resultiert daraus das so ge-nannte leaky scanning, bei welchem die Translation meist erst am zweiten AUG-Codon ge-startet wird (KOZAK 1986b; KOZAK 1987b; KOZAK 1987c). Über die Konsensus-Sequenz parasitischer Nematoden liegen bislang keine Kenntnisse vor. Wird daher von der Vertebra-ten-Konsensus-Sequenz auf parasitische Nematoden extrapoliert, ergibt sich für das erste

Diskussion 189

AUG-Triplett der Sequenzen L3ni 22 und L3i 53 ein suboptimaler Kontext. Auf die Möglich-keit, dass am ersten AUG-Codon der Translationsstart durch ein A oder G an den Positionen – 3 bzw. + 4 auch bei D. viviparus erzwungen werden könnte, deutet die Analyse der ab die-sem Triplett translatierten full-length cDNA-Sequenzen hin. So besitzen die L3ni 51-, L3ni 69/92- und L3i 82/101-Sequenzen an Position – 3 ein A, die L3i 82/101 trägt zudem noch ein G an Position + 4. Bei den L3ni 56-Sequenzen befindet sich an diesen Positionen jeweils ein G. Dieses G existiert bei den Sequenzen L3ni 16 und L3i 10b hingegen nur an Position – 3, an welcher es die Translationseffizienz weniger stark beeinflusst als ein A (KO-ZAK 2002). Bei den Sequenzen L3i 100a und 100c ist allein an Position + 4 ein G befindlich.

Für eine eventuelle Bedeutung dieser Nukleotide bezüglich der Translationseffizienz spricht weiterhin, dass das ausgewählte Startcodon der L3i 53, welches vom zweiten AUG-Codon der Nukleinsäuresequenz repräsentiert wird, an Position – 3 ein A und an + 4 ein G besitzt.

Auch beeinflussen die das AUG-Triplett umgebenden Sekundärstrukturen die Translationsef-fizienz, da diese eine Verlangsamung des Ribosoms bedingen und so zur besseren Erkennung des Initiationscodons beitragen (KOZAK 1986a). Bezüglich der L3i 10a und L3i 18/86 kann eine Bindung des Ribosoms an eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (PELLETIER u. SO-NENBERG 1988) vermutet werden, da sich stromaufwärts des als Startpunkt ausgewählten Tripletts mehrere AUG-Codons befinden.