Replikation von HIV-1.
Da mit Hilfe des monozyklischen MAGI-Tests nur das frühe Stadium des HIV-1 Replikationszyklus abgebildet wird, wurden die Mutanten in verschiedenen permissiven Zellkultursystemen getestet, die einen vollständigen Replikationszyklus erlauben. Dazu wurden periphäre mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von HIV-1 negativen Spendern und zwei T-lymphozytoide Krebszelllinien (CEM und MT4) mit normalisierten virushaltigen Überständen transfizierter 293T-Zellen infiziert. Die Gewinnung und Kultivierung dieser Zellen ist unter Abschnitt F4.1 dokumentiert. Das Replikationsverhalten der Virusmutanten wurde durch regelmäßige Bestimmung des CA-Gehaltes in den Zellkulturüberständen über einen Zeitraum von 19 Tagen beobachtet.
Abbildung C2.6 A zeigt den Replikationsverlauf des NL4-3 Wildtypvirus (Wt) und der Δnef-Variante in PBMCs, sowie die Kinetiken der Mutanten a-f, der Mutante dup und der entsprechenden Variante mit Duplikation und Nef-Deletion (Mdup Δnef). Man erkennt nach einem schnellen Anstieg der p24-Konzentration im Wt-Ansatz, dass die Virusmenge am Tag 5 nach Infektion ihren maximalen Wert erreicht hat. Dies trifft auch für die Mutanten a-f zu (Zur besseren Unterscheidung der Viruskonzentrationen in den einzelnen Replikationsansätzen wurden die p24-Mengen zu diesem Zeitpunkt in einem Balkendiagramm aufgetragen, wie in Abbildung C2.6 D gezeigt). Die Mutanten Δnef und dup Δnef wiesen hingegen einen wesentlich flacheren Anstieg der Replikationskurve auf. In diesen Ansätzen wurde die höchste p24-Konzentration erst am Tag 11 bzw. 13 erreicht.
Wie bei Infektion der MAGI-Reporterzelllinie, zeigte sich auch beim Replikations-verhalten von HIV-1NL4-3 in PBMCs eine deutliche Nef-Abhängigkeit. Am Tag 5, an dem der Wt-Replikationsansatz seine maximale Virusproduktion erreicht hatte, war die des Δnef-Ansatzes um mehr als das 20-fache verringert, was aus Abbildung C2.6 D deutlich hervorgeht. Vergleicht man die Verläufe der Replikationskinetiken von Wt und Δnef in Abbildung C2.6 A, so lässt sich die verringerte Replikationskompetenz von Δnef an drei Faktoren festmachen: Erstens ist die Zunahme der p24-Konzentration deutlich verringert, was aus der geringeren Steigung der Kurve ersichtlich ist.
Zweitens ist der maximale Virustiter geringer als beim Wt und drittens ist der Zeitpunkt, an dem der maximale Virustiter auftritt, deutlich verzögert. Für die Mutanten a-e konnte hingegen kein nennenswerter Unterschied im Replikationsverhalten bezogen auf den Wt festgestellt werden, da hier die Steigung der Replikationskurve,
der Zeitpunkt und die Höhe des maximalen Virustiters annähernd identisch waren.
Jedoch lässt sich eine, im Vergleich zum Wt leicht erhöhte Viruskonzentration an Tag 5 bei Mutante f und Mutante dup erkennen. Vergleicht man die beiden Nef-defizienten Virusmutanten Δnef und dup Δnef miteinander, scheint auch hier die Duplikation in p6* einen positiven Einfluss auf die Replikation zu haben. Dieser positive Effekt auf die Replikation ist jedoch weit geringer als der, den Nef vermittelt.
Ähnlich wie in der Infektionsstudie scheint die Duplikation auch die Replikation von Nef-defizienten und Nef-exprimierenden Viren gleichermaßen zu begünstigen.
Der Vergleich der beiden Zellkultursysteme PBMC und CEM zeigte, dass die Replikation in PBMCs rascher zu großen Mengen an neuen Viren führte. Mikroskopie und der Verlauf der Replikationskinetiken ergaben, dass der Zeitpunkt, zu dem alle Zellen eines Ansatzes infiziert waren, schneller erreicht wurde als in CEM-Zellen. Bei der Replikation von Wt-Viren in PBMCs wurde der maximale Virustiter bereits am Tag 5 mit einer CA-Konzentration von über 500 ng/ml erreicht. In CEM-Zellen lag sie zum selben Zeitpunkt bei unter 5 ng/ml, der maximale Virustiter trat erst 8 Tage später auf (vergleiche Abbildung C2.6 A mit B). Eine verzögerte Replikation führte in den Zellkulturen zu höheren Zellzahlen, da uninfizierte Zellen weiter proliferieren. Daher ist die ermittelte Menge an p24 zu späteren Zeitpunkten auch höher, weil mehr Zellen infiziert werden konnten. Zudem handelt es sich bei CEM um eine immortalisierte Zelllinie, deren Proliferation verglichen mit PBMCs, die nicht oder nur sehr begrenzt Zellteilungen eingehen, deutlich erhöht ist.
Betrachtet man die Verläufe der Replikationskinetiken von Wt und Δnef in CEM-Zellen (Abbildung C2.6 B), erkennt man auch hier die starke Nef-Abhängigkeit der Replikation. Die Steigung der Δnef-Replikationskurve zwischen Tag 7 und 11 ist deutlich geringer als die des Wt. Ab diesem Zeitpunkt entspricht die Steigung aber der des Wt zwischen Tag 9 und 13. Der maximale Virustiter wird im Δnef-Ansatz an Tag 17 und im Wt-Ansatz an Tag 13 erreicht (Abbildung C2.6 E). Die Tatsache, dass die p24 Menge in den Δnef-Ansätzen am Tag 17 höher ist als die des Wt an Tag 13, lässt sich wieder über die höhere Zellanzahl zu diesem Zeitpunkt erklären. Trotzdem beeinträchtigte ein Fehlen von Nef die Virusreplikation in CEM-Zellen nicht in dem Maße, wie es in PBMCs zu beobachten war (vergleiche Abbildungen C2.6 A und D mit B und E). Darüber hinaus zeigte sich, im Gegensatz zu den Ergebnissen mit PBMCs, bei Nef-exprimierenden Viren kein positiver Einfluss der Duplikation auf die Replikation. Bei Nef-defizienten Viren rief die Duplikation sogar einen deutlich negativen Effekt auf die Replikation hervor. Die Mutanten a-f zeigten dagegen Wt-ähnliches Replikationsverhalten.
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Abbildung C2.6 Einfluss der p6* Mutationen auf die virale Replikation. 293T-Zellen wurden mit den angegebenen Konstrukten transfiziert und der CA (p24)-Gehalt in den virushaltigen Überständen 72 Stunden nach der Transfektion über einen p24-ELISA quantifiziert. Zur Bestimmung der Replikationskinetiken wurden 2x106 PBMCs, CEM und MT4-Zellen jeweils mit gleichen Mengen an Viruspartikeln (normiert über die quantifizierten p24-Mengen) in Doppelansätzen infiziert. Im Abstand von zwei Tagen wurden Proben der Überstände gewonnen und deren Viruskonzentration mit einem p24-ELISA bestimmt (A, B, C). Die Balkendiagramme (D, E, F) zeigen die p24-Menge in den Überständen der einzelnen Replikationsansätze zum Zeitpunkt des maximalen Wt-Virustiters. Die Kurvenpunkte der Replikationskinetiken entsprechen den Mittelwerten von Doppelansätzen. Die entsprechenden Standardabweichungen sind angegeben. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit unterschiedlichen Viruspräparationen.
MT4-Zellen sind permissive, besonders leicht infizierbare Zellen. Im Gegensatz zu CEM-Zellen replizieren Nef-exprimierende und Nef-defiziente HI-Viren in ihnen annähernd gleich gut (47). Dies geht auch hier aus dem Vergleich der Replikationskurven von Wt und Δnef hervor (Abbildung C2.6 C und F). Deshalb wurde diese Zelllinie herangezogen, um mögliche Nef-unabhängige Effekte der p6*-Mutationen in replizierenden Viren zu quantifizieren. Wie dargestellt, zeigte keine der Mutanten einen deutlich vom Wt abweichenden Replikationsverlauf. Unabhängig von Nef konnte damit kein Einfluss der p6*-spezifischen Mutationen auf die virale Replikation in MT4-Zellen festgestellt werden.
Zusammengefasst zeigen diese Replikationsexperimente, dass die schrittweise Mutation der zentralen p6*-Region, realisiert in den Mutanten a-f, keinen signifikanten Einfluss auf die Kinetik der Virusreplikation in und MT4-Zelllinien hatte. In
CEM-Zellen wirkte sich die Duplikation im zentralen Bereich von p6* negativ auf die Replikation Nef-defizienter Viren aus. Auf Nef-exprimierenden Viren hatte sie keinen Einfluss. Im Gegensatz dazu begünstigte diese Duplikation unabhängig von Nef die Replikation in PBMCs, was am ehesten einer in vivo-Situation entspricht.