Wie die Ergebnisse aus dem vorangegangenen Abschnitt zeigten, war die Mutante ALdel-myc, bei der die zentrale p6*-Sequenz durch ein myc-tag ersetzt worden war, im Stande, infektiöse Viruspartikel zu bilden und in verschiedenen Zellkultursystemen zu replizieren. Im Folgenden sollte nun überprüft werden, ob in den p6*-ORF inserierte tags auch in Viruspartikeln verpackt werden und dort nachweisbar sind.
Dazu wurden 293T-Zellen mit den proviralen Konstrukten AL und ALdel-myc transfiziert und Zellkulturüberstand drei Tage nach der Transfektion gesammelt. Darin enthaltene Viruspartikel wurden analog zu Abschnitt C2.10 über Ultrazentrifugation aufkonzentriert und lysiert und mit einem myc-spezifischen Antikörper einer Western Blot-Analyse unterzogen. Durch die Prozessierung des Gag-PolALdel-myc -Polyprotein-vorläufers (Abbildung C3.8 B) erwartete man ein nur 3,2 kDa kleines myc-Produkt, das durch die Spaltung an der internen und carboxylterminalen p6*-Spaltstelle hervorgehen sollte. Den Zellen wurde daher vier Stunden nach der Transfektion der PR-Inhibitor Saquinavir zugegeben, um die vollständige Prozessierung des
Gag-Pol-Vorläufers zu verhindern und den Nachweis von myc-spezifischen Produkten zu erleichtern. Wie Abbildung C3.8 A deutlich macht, konnten in der Tat mehrere myc-spezifische Signale in den ALdel-myc-Viruspartikeln detektiert werden, die zeigen, dass myc tatsächlich ein Teil des in Viruspartikeln inkorporierten Gag-Pol-Vorläufers ist. Darüber hinaus entsprachen die myc-spezifischen Proteinbanden (a-e) zwischen 60 und 170 kDa den errechneten Größen der Gag-PolALdel-myc -Prozessierungs-intermediate. Danach kommt es im 167,5 kDa großen Gag-PolALdel-myc-Vorläufer zu einer ersten Spaltung zwische p2 und NC, die ein 41 kDa großes MA-CA-p2 und ein 125,6 kDa großes NC-p1-p6gag-p6*myc-PR-RT/RNAseH-IN-Intermediat hervorbringt.
Im Anschluss daran liefert die Prozessierung der internen p6*-Spaltstelle zwischen den Aminosäuren F8 und P9, die auch bei ALdel-myc vorliegt, ein 110,5 kDa großes p6*P9myc-PR-RT/RNAseH-IN-Produkt. Die Abtrennung der IN resultiert in einem 78,3 kDa p6*P9myc-PR-RT/Intermediat, von dem schließlich die RNAseH-Domäne in einem letzten Schritt abgespalten wird. In Anwesenheit von Saquinavir stellte p6*P9myc-PR-RT mit 65,3 kDa somit das letzte Prozessierungsintermediat dar.
Dieses Prozessierungsschema ist weitgehend in Einklang mit früheren Berichten verschiedener Gruppen, die sich mit PR-vermittelter Polyprotein-Prozessierung bei HIV beschäftigt hatten (126;166;167) Offensichtlich verändert die Insertion von myc in den p6*-ORF die Prozessierung bzw. Maturation von Gag-Pol nicht.
Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass es auf der Grundlage von AL möglich ist, Reporter-Sequenzen in den p6*-ORF zu inserieren, um Partikel-assoziierte Prozessierungsschritte aufzuklären.
Ausgehend von den vorliegenden Daten sollte nun ermittelt werden, wie sich die Insertion einer wesentlich größeren heterologen Sequenz in den p6*-ORF auswirkt.
Dazu wurde das Gen für das 27 kDa große green fluorescent protein (GFP) in Analogie zu der in Abschnitt C3.5 beschriebenen Herstellung von ALdel-myc an Stelle der zentralen p6*-Region in Gag-Pol inseriert. Um festzustellen, ob GFP im p6*-ORF exprimiert und anschließend in Viruspartikel verpackt wird, transfizierte man 293T-Zellen mit dem als ALdel-GFP (Abbildung C3.8 C) bezeichneten Plasmidkonstrukt, mit AL oder einem Leervektor (- Kontrolle). Nach 72 Stunden wurden die Überstände filtriert und die enthaltenen Viruspartikel über Ultrazentrifugation aufkonzentriert, lysiert und einer Western Blot-Analyse mit einem GFP-spezifischen Antikörper unterzogen.
Å A
a = Gag-PolALdel-myc: 167,5
b = NC-p1-p6gag-p6*myc-PR-RT/RNAseH-IN: 125,6 kDa c = p6*P9myc-PR-RT/RNAseH-IN: 110,5 kDa d = p6*P9myc-PR-RT/RNAseH: 78,3 kDa
e = p6*P9myc-PR-RT: 65,3 kDa
Abbildung C3.8 Inkorporation heterologer Sequenzen aus dem p6*-ORF in Viruspartikel.
293T-Zellen wurden mit AL- und ALdel-myc Provirus-Konstrukten und einem Leervektor in Gegenwart des PR-Inhibitors Saquinavir transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die gebildeten Viruspartikel im Überstand geerntet, über Ultrazentrifugation aufkonzentriert und die Proteine über ein denaturierendes Gel chromatographisch aufgetrennt. Die Detektion myc-spezifischer Prozessierungsintermediate erfolgte in einer Western Blot-Analyse mit myc-spezifischen-Antikörpern über Chemilumineszenz (A). Der Gag-Pol-Polyproteinvorläufer der Mutante ALdel-myc ist schematisch dargestellt. Die myc-Insertionen in den p6*-ORF (weiße Box) und die dem Prozessierungsmuster in A entsprechenden PR-Spaltstellen (Δ) sind hervorgehoben (B). Anstelle von myc wurde in ALdel-GFP die zentrale p6*-Region durch das GFP-Reportergen (weiße Box) ersetzt (C). 293T-Zellen wurden mit AL- und ALdel-GFP Provirus-Konstrukten und einem Leervektor transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die gebildeten Viruspartikel im Überstand geerntet, über Ultrazentrifugation aufkonzentriert und GFP analog zu A über Chemilumineszenz nachgewiesen (D). Die Positionen der Markerproteine sind angegeben.
Wie Abbildung C3.8 D zeigt, wurde ein GFP-spezifisches Produkt bei ungefähr 27 kDa in ALdel-GFP-Partikeln, aber nicht in AL-Partikeln nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass GFP bzw. p6* mit GFP als Substitution der zentralen Region (p6*P9GFP) exprimiert und in Viruspartikel inkorporiert wurde. Darüber hinaus konnte ein zweites, etwa 39 kDa großes Produkt detektiert werden, bei dem es sich mit hoher
Wahrscheinlichkeit um ein GFP-PR bzw. p6*P9GFP-PR-Intermediat handelt. Allem Anschein nach wurde das Partikel-assoziierte GFP nicht quantitativ aus dem Gag-Pol-Vorläufer freigesetzt.
Die obigen Daten zeigen, dass das Virus AL bzw. ALdel, welches für ein verkürztes p6* kodiert, als Plattform dient, um heterologe Peptide oder Proteine in Viruspartikel einzuführen.