Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von p6* für die virale Replikation weiter zu analysieren. In Ergänzung früherer Arbeiten sollte der Einfluss einer verzögerten Prozessierung der carboxylterminalen p6*-Spaltstelle für die Virusreplikation genauer untersucht werden. Im Focus dieser Arbeit stand, die Rolle der zentralen p6*-Region (downstream des Leserastersprungbereichs und upstreamder Kodierungssequenz für die p6*-PR-Spaltstelle) für die Replikation Nef-exprimierender Viren aufzuklären.
Ausgangspunkt hierfür war die postulierte Interaktion zwischen Nef und p6* (40). Nach der Beobachtung, dass eine Nef-Deletion die Virusreplikation weniger stark beeinträchtigt, wenn p6* eine Duplikation im zentralen Bereich aufweist (155), sollte eine mögliche Kompensation von Nef durch eine Duplikation in der zentralen p6*-Region überprüft werden.
B Zusammenfassung
Auf Grund der Genomorganisation von HIV-1 ist das transframe-Protein p6*
Bestandteil des Gag-Pol-Polyproteinvorläufers und liegt dort zwischen dem vom gag-Gen kodierten Nukleocapsid-Protein (NC) und der vom pol-gag-Gen kodierten Protease (PR). P6* selbst wird vom 5´Ende des pol-Gens kodiert. Die Translation zweier Polyproteinvorläufer, Gag und Gag-Pol, wird durch einen -1 ribosomalen Lese-rastersprung an einer frame shift-Region der RNA ausgelöst. Diese hoch konservierte Region liegt im Kodierungsbereich für den Aminoterminus von p6*. Darüber hinaus ist p6* und die ebenfalls pol-kodierte PR mit p1 und p6gag des gag-Leserasters über-lagert.
Abgesehen von seinem Aminoterminus ist auch der Carboxylterminus von p6* hoch konserviert. In unserer Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass rekombinant hergestelltes p6* die PR konzentrationsabhängig hemmt. Für diesen Effekt ist hauptsächlich das carboxylterminale Tetrapeptid von p6* verantwortlich (162). Darüber hinaus stellt es den p6*-Anteil der p6*-PR-Spaltstelle dar, deren Prozessierung für die Freisetzung und vollständige Aktivierung der PR essenziell ist.
Mutationen am p6*-Carboxylterminus führten entweder zu einer Verzögerung oder zu einer Blockade der Prozessierung, die im Provirus HX10 unterschiedlich schwere Prozessierungsdefekte hervorriefen. Jedoch konnte für Mutationen, die die Prozessierung verzögerten, bisher kein messbarer Einfluss auf die virale Replikation belegt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in einem sensitiveren Testsystem gezeigt, dass auch geringere Prozessierungsdefekte für die entsprechenden Virusmutanten zu einem Replikationsnachteil gegenüber dem Wildtyp (Wt) führen (134).
Um die Rolle der zentralen p6*-Region im Lebenszyklus von HIV-1 in Zusammenhang mit einer postulierten Interaktion von p6* und Nef während der Virusreplikation (40) aufzuklären, wurden in dieser Arbeit sequentielle Mutationen in die kodierende Region von p6* eingeführt. Die Mutationen in der zentralen p6*-Region wählte man so, dass sie die überlagerten p1- und p6gag-Leserahmen unberührt ließen. Als Basis der Mutagenesestudien diente dabei das Nef-kodierende HIV-1-Isolat NL4-3. Es stellte sich heraus, dass die zentrale p6*-Region weder Einfluss auf den Leserastersprung noch auf die Produktion der Polyproteinvorläufer hat. Auch für die Aktivität der PR
oder für die Inkorporation von Nef in Viruspartikel spielt sie keine Rolle. Eine Interaktion mit Nef konnte für diesen Bereich von p6* ausgeschlossen werden. Jedoch bewirkte eine Substitution der gesamten zentralen p6*-Region einen Rückgang der viralen Infektiosität und Replikation in vitro.
Eine in einigen Isolaten beschriebene Allelvariation von p6* ist eine 11 Aminosäuren umfassende Duplikation im zentralen Bereich. Diese Duplikation wies einen Zelltyp-abhängigen Einfluss auf die Replikation auf.
Mutationen im p6*-Aminoterminus beeinflussen unausweichlich die frame shift-Region oder den überlagerten gag-Leserahmen. So zeigte sich in zurückliegenden Arbeiten unserer Arbeitsgruppe, dass sich Substitutionen in dieser Region von p6* auf die Effizienz des ribosomalen Leserastersprunges und folglich negativ auf die Virusreplikation auswirken (163). Da eine spezifische Mutagenese des p6*-Amino-terminus nicht möglich ist, ohne dabei überlagerte Strukturen zu manipulieren, ist die Rolle dieser Region für die Virusreplikation von HIV-1 noch unbekannt. Daher wurde in dieser Arbeit ein neues HI-Provirus konstruiert, bei dem die frame shift-Region so versetzt wurde, dass die beiden Leserahmen gag und pol entkoppelt vorliegen. Für dieses Virus konnte gezeigt werden, dass die neu generierteframe shift-Region einen funktionellen Leserastersprung auslöst, der zur Translation der Gag und Gag-Pol-Polyproteinvorläufer führt. Deren Prozessierung sowie Infektiosität und Replikations-fähigkeit entsprachen annähernd dem des NL4-3-Isolats. Damit repräsentiert dieses Viruskonstrukt ein neues wertvolles Werkzeug für die Analyse der HIV-1 Replikation.
Es erlaubt erstmalig die frame shift-Region p1 und p6gag, sowie p6* und die PR unabhängig voneinander auch durch Deletions- oder Insertions-Mutagenese zu manipulieren.
Mutationsanalysen, die im Kontext dieses neuen Virus durchgeführt wurden, ergaben, dass auch der p6*-Aminoterminus für die in vitro-Infektiosität und -Replikation von HIV-1 nicht essenziell ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Deletion der gesamten zentralen p6*-Region in vitro keine erkennbaren Nachteile für den Replikationszyklus mit sich bringt. Im Gegenteil, die Virusreplikation wurde sogar beschleunigt. Weiterhin wurde festgestellt, dass Reportergene in den p6*-Leserahmen eingebracht werden können, die die zentrale p6*-Region ersetzen. Mit zunehmender Größe schränken diese Insertionen die Funktionalität des Virus jedoch ein. Daher wird vermutet, dass die Aktivität der PR vom Abstand zu ihren aminoterminal gelegenen Spaltstellen im Gag-Pol-Vorläufer abhängt und dass diese Insertionen in den
p6*-Leserahmen die Dimerisierung und die Faltung der PR im Gag-Pol-Vorläuferprotein stören.
Diese Arbeit kommt somit zu dem Ergebnis, dass der Carboxylterminus von p6* für die PR-Aktivität und damit für die Replikation des HI-Virus von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz dazu ist die Gestalt des Aminoterminus für die Funktionalität des Virus ebenso unerheblich wie die zentrale Region von p6*. Es wird daher angenommen, dass sie die Funktion eines spacers einnimmt, um in vivo dem Virus Raum für escape-Mutationen zu bieten.