3. Identifizierung unbekannter Metabolite
3.3. Vorstellung der Metabolite
3.3.2. Proteinogene Aminosäuren
Indol-Derivate die in der 2. oder 3. Position substituiert sind, weisen sehr ähnliche Strukturen auf. Dementsprechend dicht liegen ihre Resonanzfrequenzen beieinander. Die Signale von Indoxylsulfat, Indolessigsäure und einem weiteren Indol-Derivat, Tryptophan (siehe 3.3.2.2.
aromatische Aminosäuren) überlagern sich und sind im Protonenspektrum nicht auseinander zu halten. Im COSY-Spektrum zeigen die Signale der Indol-Derivate ein charakteristisches Kopplungsmuster. Aber auch hier ist zu erkennen, dass die Signale sich überlagern.
Indole
ppm (t2)7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
7.30
7.40
7.50
7.60
7.70
7.80
7.90 ppm (t1) Indole
ppm (t2)7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
7.30
7.40
7.50
7.60
7.70
7.80
7.90 ppm (t1)
Abbildung 20: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Kopplungssignale der Indol-Derivate.
Aufgrund der strukturellen Gemeinsamkeiten kommt es zu Überlagerungen der Signale.
Durch diese hydrophoben Wechselwirkungen wird die Proteinstruktur stabilisiert. In den Urinproben konnten die unpolaren Aminosäuren Glycin, N, N-Dimethylglycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin identifiziert werden.
Glycin ist die einfachste Aminosäure. Sie wird aus Serin, Threonin oder Glyoxylat gebildet und ist hauptsächlich Bestandteil der Skleroproteine (z. B. Kollagen). Glycin ist ein wichtiges Zwischenprodukt der Biosynthese von Porphyrinen, Purinen, Creatin und Glutathion. Es wird über Glyoxylsäure zu Oxalsäure oder über Serin abgebaut. Vermehrte Glycinausscheidung in den Urin kann unter anderem durch einen erblichen Defekt im Glycintransport im proximalen Tubulus erfolgen. Nicht-ketotische Hyperglycinämie kann durch verschiedene Enzymdefekte verursacht werden und führt ebenfalls zu erhöhten Konzentrationen im Urin (Tada und Hayasaka, 1987).
N, N-Dimethylglycin ist ein Derivat der Aminosäure Glycin. Es entsteht beim Abbau von Cholin zu Glycin und ist auch ein Nebenprodukt des Homocystein-Stoffwechsels.
Dimethylglycin Dehydrogenase Mangel führt zu einer vermehrten Urinausscheidung von N, N-Dimethylglycin (Binzak et al, 2001; Moolenaar et al, 1999).
Alanin wird durch Pyruvattransaminierung oder Spaltung der Dipeptide Carnosine und Anserin gebildet. Es ist vor allem im Muskelgewebe konzentriert und wird dort zur Energiegewinnung freigesetzt. Das Hartnup-Syndrom ist ein erblicher Transportdefekt für Monoaminocarboxyl-Säuren in Nieren und Dünndarm (Bröer et al, 2005). Alanin ist eine von mehreren Aminosäuren, die bei diesem Syndrom vermehrt mit dem Urin ausgeschieden werden. Daneben gibt es verschiedene Enzymdefekte, z. B. Pyruvat-Dehydrogenase-Mangel, die ebenfalls zu erhöhten Konzentrationen im Urin führen.
Valin, Leucin und Isoleucin gehören zu den essentiellen Aminosäuren. Sie werden als verzweigtkettige Aminosäuren bezeichnet und kommen in geringen Mengen in allen Proteinen vor. Valin ist eine Biosynthesevorstufe für Panthothensäure und unentbehrlich für Nerven- und Muskelfunktion. Leucin ist wichtig für den Aufbau und Erhalt von Muskelgewebe. Es unterstützt die Proteinsynthese in Muskelgewebe und Leber und hemmt den Abbau von Muskelprotein. Isoleucin ist für den Muskelaufbau von Bedeutung, da seine hydrophoben Eigenschaften für die Ausbildung der Sekundärstruktur hilfreich sind. Rund ein Drittel der Muskulatur besteht aus dieser Aminosäure. Es gibt viele Stoffwechselstörungen dieser Aminosäuren, die bekannteste wird als Ahornsirupkrankheit bezeichnet (Chuang et al, 2006; Harris et al, 2005). Diese Krankheit führt unter anderem zu einer vermehrten Ausscheidung von Valin, Leucin und Isoleucin mit dem Urin. Auch das Hartnup-Syndrom
Diese unpolaren Aminosäuren sind in dem Protonenspektrum relativ einfach zu identifizieren.
Sie tragen aliphatische Seitenketten, deren Resonanzfrequenzen weit hochfeldverschoben liegen. Diese Signale sind auch für analytische Zwecke geeignet, da dort nur wenige Überlagerungen vorliegen. Eine Ausnahme bilden hier Glycin und N, N-Dimethylglycin, da sie keine langen Seitenketten besitzen. Ihre Signale liegen bei 3,57ppm bzw. 3,72ppm und 2,91ppm. Alanin zeigt ein deutliches Dublett bei 1,47ppm und Valin zwei Dubletts bei 1,03ppm und 0,98ppm. Die beiden Dubletts von Leucin bei 0,93ppm und 0,95ppm liegen im Protonenspektrum sehr dicht beieinander. Isoleucin ist nur sehr gering konzentriert, so dass sein Signal bei 1,97ppm im Protonenspektrum kaum sichtbar ist.
ppm (t1) 2.00 1.50 1.00
Ala
Val Leu Ile
ppm (t1) 2.00 1.50 1.00
Ala
Val Leu Ile
Abbildung 21: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der unpolaren Aminosäuren Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu) und Isoleucin (Ile).
3.3.2.2. Aromatische Aminosäuren
Die Seitengruppen dieser Aminosäuren sind relativ unpolar und können ebenfalls an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt sein. In den Urinproben konnten die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan identifiziert werden.
Phenylalanin gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es ist an der Synthese von Adrenalin, L-Dopa und anderen Hormonen beteiligt und dient als Edukt für weitere Substanzen, z. B. für die Botenstoffe Dopamin, Serotonin oder Tyramin im Gehirn. Das Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005), Phenylketonurie und mildere Formen von Hyperphenylalaninämie verursachen neben dem Erscheinen von Phenylbrenztraubensäure eine vermehrte Ausscheidung von Phenylalanin im Urin (Kitagawa et al, 1975).
Tyrosin ist ein zentraler, intermediärer Metabolit für Schilddrüsenhormone, Catecholamine und Melanine. Erhöhte Tyrosin Konzentrationen im Urin werden unter anderem durch das Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005) oder Hypertyrosinämie (Balato et al, 1986; Machino et al, 1983) verursacht.
Tryptophan gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es ist Bestandteil vieler Proteine,
Stoffwechsel diverser B-Vitamine beteiligt. Eine vermehrte Ausscheidung von Tryptophan über den Urin wird durch Tryptophanurie und dem Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005) verursacht.
Die aromatischen Aminosäuren sind Analoga der aromatischen Säuren Phenylessigsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure und Indolessigsäure. Dementsprechend dicht liegen die Signale der jeweiligen Verbindungen beieinander. Die aromatischen Resonanzfrequenzen des Tryptophans sind im COSY von denen der anderen enthaltenen Indole überlagert (siehe 3.3.1.2.3. Indole und Imidazole). Die aromatischen Signale des Phenylalanins sind im HSQC und im COSY nicht von der Phenylessigsäure zu trennen, und die des Tyrosins liegen nahe denen der 4-Hydroxyphenylessigsäure. Lediglich die aliphatischen Seitenketten unterscheiden sich. Die gebundene Aminogruppe schränkt die freie Drehbarkeit der danebenliegenden Methylengruppe ein, so dass die Protonen nicht mehr chemisch äquivalent sind und zu zwei Signalen aufspalten. Die Identifizierung erfolgt deshalb am besten über die Kopplungssignale der aromatischen Protonen zu denen der aliphatischen Seitenketten. Dort ist der Effekt der Aufspaltung deutlich zu erkennen.
ppm (t2)7.60 7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
3.00
3.50
ppm (t1)
Phenylalanin Tyrosin
Tryptophan
ppm (t2)7.60 7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
3.00
3.50
ppm (t1) ppm (t2)7.60 7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
3.00
3.50
ppm (t1)
Phenylalanin Tyrosin
Tryptophan
Abbildung 22: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der aromatischen Aminosäuren. Die aromatischen Signale koppeln jeweils zu zwei aliphatischen Protonen, da die Protonen der Methylengruppe nicht chemisch äquivalent sind und zu zwei Signalen aufspalten. Ein Signal von Tryptophan ist durch das einer anderen Verbindung überlagert.
3.3.2.3. Polare, ungeladene Aminosäuren
Die Seitengruppen dieser Aminosäuren sind hydrophil. Ihre funktionellen Gruppen können Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden und dadurch die Wasserlöslichkeit der Proteine steigern. In den Urinproben konnten die Aminosäuren Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Cystin und Pyroglutamat identifiziert werden.
Serin kommt in Phospholipiden von Zellmembranen vor. Die Biosynthese von Serin erfolgt ausgehend von 3-Phosphoglycerat oder Glycin. Es kann aber auch durch Protein- oder Phospholipidabbau freigesetzt werden. Serin spielt eine zentrale Rolle beim Zellwachstum und wird zum Aufbau von Cholin, Cystein und Purin-Nukleotiden benötigt. Außerdem ist es wichtig für die Entwicklung und Funktion des Gehirns.
Threonin gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es wird für den Harnsäure-Stoffwechsel und das Immunsystem benötigt, ist an der Biosynthese von Vitamin B12 beteiligt und spielt eine Rolle im Stoffwechsel von Prophyrin. Erhöhte Konzentrationen im Urin werden unter anderem durch das Hartnup-Syndrom verursacht (Bröer et al, 2005).
Asparagin wird aus Ammoniak und Asparaginsäure gebildet. Es wirkt wachstumsfördernd, spielt eine Rolle in der Stoffwechselüberwachung in Hirn- und Nervengewebe und stellt eine NH2-Quelle im Intermediärstoffwechsel für die Harnstoffsynthese dar. Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die zu veränderten Urin Konzentrationen führen, sind bisher nicht bekannt.
Glutamin wird aus Glutaminsäure gebildet. Es ist für den Hirnstoffwechsel von Bedeutung, wird als NH2-Donor bei Transaminierungen eingesetzt und für NH3-Bindung und -Transport benötigt. Erhöhte Konzentrationen im Urin werden unter anderem durch das Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005) oder dem LOWE-Hartnup-Syndrom verursacht. Ein Glutamin-Synthetase-Mangel (Haberle et al, 2005) führt dagegen zu einer stark reduzierten Ausscheidung von Glutamin.
Cystin ist eine schwefelhaltige Aminosäure. Es ist das Oxidationsprodukt von zwei Cysteinmolekülen, welche über eine Disulfidbindung verknüpft sind. Cystein wird aus Methionin gebildet und über Aminoacrylat zu Pyruvat abgebaut. Im extrazellulären Raum liegt nur die oxidierte Form vor. Cystin ist hauptsächlich in Haaren und Haut zu finden und spielt eine wichtige Rolle im Immunsystem. Erhöhte Konzentrationen im Urin treten bei Cystinurie, einer Störung des renalen Transportsystems, auf (Font-Llitjos et al, 2005).
Die zyklisierte Glutaminsäure Pyroglutamat bzw. 5-Oxoprolin steht am Anfang von Peptidketten und entsteht als Artefact bei der Lyophylisierung. Der Enzymdefekt
Glutathion-Die Signale der polaren Aminosäuren liegen zum Teil in dem stark überlagerten Bereich der Kohlenhydrate, die nicht für die Identifizierung geeignet sind. Threonin, Asparagin und Glutamin zeigen aber auch Signale, die weiter hochfeldverschoben liegen und für analytische Zwecke geeignet sind. Threonin trägt eine Methylgruppe, deren Signal bei 1,33 liegt, Glutamin zeigt zwei Signale zwischen 2ppm und 3ppm bei 2,45ppm und 2,14ppm, die zusammen zur Identifizierung genutzt werden sollten, da beide überlagert sind. Die Resonanzfrequenz der Methylengruppe des Asparagins ist zu zwei Signalen bei 2,91ppm und 2,99ppm aufgespalten, von denen eins bei 2,91ppm nicht überlagert ist. Pyroglutamat zeigt mehrere Signale in dem Bereich zwischen 2ppm und 3ppm. Die Signale bei 2,49ppm und 2,02ppm werden von einer Methylengruppe verursacht, die zu zwei Signalen aufspaltet.
ppm (t1) 2.50 2.00 1.50
Asn
Asn
PGlu Gln
PGlu
Gln PGlu
Thr
ppm (t1) 2.50 2.00 1.50
Asn
Asn
PGlu Gln
PGlu
Gln PGlu
Thr
Abbildung 23: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der polaren Aminosäuren Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Pyrolutamat (PGlu) und Threonin (Thr).
Serin zeigt nur Signale in dem überlagerten Bereich bei 3,87ppm, 3,95ppm und 3,99ppm und kann auch im HSQC nur schlecht identifiziert werden, da die korrespondierenden Kohlenstoffe bei 57,47ppm und 61,42ppm auch überlagert sind. Die Resonanzfrequenzen der Protonen von Cystin liegen ebenfalls in dem überlagerten Bereich bei 4,13ppm, 3,39ppm und 3,21ppm, aber der korrespondierende Kohlenstoff der aufgespalteten Methylengruppe liegt so weit hochfeldverschoben bei 38,74ppm, dass es im HSQC deutlich identifiziert werden kann.
ppm (t2)4.00 3.50 3.00
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
ppm (t1) Cys2
Ser
ppm (t2)4.00 3.50 3.00
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
ppm (t1) Cys2
Ser
Abbildung 24: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die aufgespaltenen Signale vom Cystin (Cys2). Das Signal von Serin (Ser) ist nicht so leicht zu identifizieren, da es überlagert ist.
3.3.2.4. Positiv geladene Aminosäuren
Geladene Seitengruppen besitzen die größte Hydrophilie. Die Ladungen ermöglichen auch häufig enzymatisch katalysierte Reaktionen. Die positiv geladenen Aminosäuren Histidin, 3-Methylhistidin, 1-3-Methylhistidin, Carnosin und Arginin konnten in den Urinproben identifiziert werden.
Histidin ist eine halbessentielle Aminosäure. Sie kommt im Globin des Blutfarbstoffes vor und ist in vielen Enzymen Bestandteil des aktiven Zentrums. Eine erhöhte Histidin Konzentration im Urin kann verschiedene Ursachen haben. Dazu gehören die durch Enzymdefekte verursachte Histidinämie, das Hartnup Syndrom (Bröer et al, 2005) und Histidinurie, welche durch einen Defekt im tubulären Transportsystem hervorgerufen wird (Nyhan und Hilton, 1992).
3-Methylhistidin ist Bestandteil von Actin und Myosin. Bei der Zersetzung dieser Muskelproteine wird es freigesetzt und mit dem Urin ausgeschieden. Deshalb gilt es als Marker für den Katabolismus von Muskelgewebe. 3-Methylhistidin wird aber auch über die Nahrung aufgenommen. Um genaue Aussagen zu treffen, wie viel 3-Methylhistidin endogen freigesetzt wurde, ist es hilfreich, zusätzlich die Konzentration von 1-Methylhistidin zu ermitteln.
1-Methylhistidin bildet mit β-Alanin das Dipeptid Anserin. Es kommt im menschlichen Gewebe kaum vor, wird aber ebenfalls mit der Nahrung aufgenommen. Seine Konzentration
Bestimmung des Anteils der mit der Nahrung aufgenommen wurde. (Tůma et al, 2005; Sjölin et al, 1989)
Carnosin oder β-Alanyl-L-Histidin ist ein Dipeptid, welches verschiedene Funktionen im menschlichen Organismus ausübt. Es wirkt als Antioxidans und als Calcium- und Enzymregulator. Außerdem verhindert es die Glykolysierung und Quervernetzungen zwischen Proteinen. Carnosinase-Mangel führt auch bei vegetarischer Ernährung zu einer vermehrten Ausscheidung von Carnosin in den Urin (Cohen et al, 1989).
Arginin ist für Kinder eine essentielle Aminosäure. Erwachsene Menschen können sie über Argininbernsteinsäure im Harnstoffzyklus synthetisieren. Arginin ist die Vorstufe für verschiedene Verbindungen im menschlichen Organismus. Es wird zu Stickstoffmonoxid, Creatin, Glutamat oder Prolin verarbeitet und kann zu Glukose umgewandelt werden.
Argininämie, ein Enzymdefekt, führt zu einer vermehrten Ausscheidung von Arginin (Sakiyama et al, 1984).
Arginin zeigt Resonanzfrequenzen im Hochfeldbereich zwischen 1ppm und 2ppm. Da diese Aminosäure nur gering konzentriert ist, hebt sich das Signal bei 1,65ppm im Protonenspektrum kaum von der Basislinie ab, während das Signal bei 1,91ppm von anderen überlagert ist. Die übrigen Resonanzfrequenzen liegen bei 3,24ppm und 3,78ppm und können aufgrund der Überlagerungen auch im HSQC nur schwer zugeordnet werden.
ppm (t1) 2.50 2.00 1.50
Arg
Arg
ppm (t1) 2.50 2.00 1.50
Arg
Arg
Abbildung 25: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt zwei Signale der Aminosäure Arginin (Arg). Das Signal bei 1,91ppm ist überlagert und kann nicht identifiziert werden. Das Signal bei 1,65ppm hebt
Histidin, 3-Methylhistidin, 1-Methylhistidin, und Carnosin lassen sich am besten über die Resonanzfrequenzen der Imidazolringe identifizieren. Im Protonenspektrum liegen die Signale dicht beieinander, sind aber deutlich separiert. Lediglich das Signal von 1-Methylhistidin bei 8,52ppm ist etwas von dem Signal einer anderen Verbindung überlagert.
Die Signale von Histidin bei 8,60ppm, 3-Methylhistidin bei 8,64ppm und Carnosin bei 8,58ppm werden nicht überlagert.
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
His
1-Met-His
3-Met-His Car
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
His
1-Met-His
3-Met-His Car
Abbildung 26: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Histidin-Derivate.
Abkürzungen: Car – Carnosin, His – Histidin, 1-Met-His – 1-Methylhistidin, 3-Met-His – 3-Methylhistidin