3. Identifizierung unbekannter Metabolite
3.3. Vorstellung der Metabolite
3.3.1.2. Heteroaromaten
Der Begriff Heteroaromaten steht für aromatische Verbindungen, die ein oder mehrere Heteroatome enthalten. Sie werden aufgrund der Art und Anzahl der Heteroatome und der Anzahl enthaltener Kohlenstoffatome in unterschiedliche Substanzklassen eingeteilt. In den untersuchten Urinproben konnten verschiedene Purine, Pyrimidine, Indole, Imidazole und Pyridine identifiziert werden.
3.3.1.2.1. Nukleoside
Ribonukleinsäure (RNA) ist eine Hauptkomponente der Genexpression. Sie setzt sich aus verschiedenen Nukleosiden zusammen, welche wiederum aus einem Ribosemolekül und einer Nukleinbase (Purin- oder Pyrimidin-Derivat) bestehen. Neben den vier bekannten Nukleosiden Adenosin, Cytidin, Uridin und Guanidin enthält RNA eine große Anzahl modifizierter Verbindungen. Bei den Modifizierungen handelt es sich hauptsächlich um Methylierungen der Basen, die im Anschluss an die RNA-Synthese erfolgen. Diese modifizierten Nukleoside können nach Abbau der RNA nicht wieder verwendet werden.
Deshalb werden sie über die Nieren mit dem Urin ausgeschieden. Dabei gehen auch immer
bekannt (Schram, 1998; Seidel et al, 2006). Mit ihrer Hilfe können Aussagen über den RNA-Stoffwechsel und über den Proteinstatus gemacht werden. Außerdem sind viele heute als Tumormarker bekannt (Zheng et al, 2002; Kammerer et al, 2005; Seidel et al, 2006). Die meisten Nukleoside und Nukleinbasen sind im Urin von gesunden Individuen jedoch so gering konzentriert, dass sie mit Hilfe der NMR nicht detektiert werde können (Zheng et al, 2002; Hofmann et al, 2003). In den untersuchten Proben konnten Adenosin, Cytidin, Cytosin, Dihydrouracil, Guanosin, Pseudouridine, Thymin, Xanthin, Uracil und Uridin identifiziert werden.
Pseudouridine ist unter anderem ein Marker für das Wachstum von Lymphknotentumoren und wird in Verbindung mit anderen Nukleosiden für die Anwesenheit verschiedener Tumore als Marker verwendet (Kvist et al, 1990; Tu et al 1995).
Uracil und Dihydrouracil werden häufig als Indikator für die Enzymaktivität der Dihydropyrimidin-Dehydrogenase eingesetzt. Wenn Tumore mit Uracilanaloga, wie zum Beispiel 5-Fluoruracil, behandelt werden, müssen die Medikamente über die Dihydropyrimidin-Dehydrogenase abgebaut werden. Ist die Enzymaktivität eingeschränkt, werden die Medikamente angereichert und können zu Vergiftungen führen (Kuhara et al, 2001).
Nukleinbasen und Nukleoside sind im Urin nur gering konzentriert. Deshalb besitzen die Signale in den Spektren auch nur schwache Intensitäten. Kopplungssignale der Nukleinbasen zu den Ribosemolekülen werden weder im COSY noch im TOCSY beobachtet. Die Ribosemoleküle der Nukleoside können jedoch mit Hilfe der α-Wasserstoffe identifiziert werden. Diese zeigen charakteristische Resonanzfrequenzen zwischen 5,8ppm und 5,9ppm und die dazugehörenden Kohlenstoffe zwischen 88ppm und 91ppm. Gegenüber den α -Wasserstoffen anderer Kohlenhydrate sind diese Signale deutlich tieffeldverschoben.
ppm (t2) 6.30 6.20 6.10 6.00 5.90 5.80 5.70
85.0
90.0
95.0
ppm (t1) Adenosine
Uridine
Guanosine
Cytidine
ppm (t2) 6.30 6.20 6.10 6.00 5.90 5.80 5.70
85.0
90.0
95.0
ppm (t1)
ppm (t2) 6.30 6.20 6.10 6.00 5.90 5.80 5.70
85.0
90.0
95.0
ppm (t1) Adenosine
Uridine
Guanosine
Cytidine
Abbildung 13: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der α-Wasserstoffe, der zu den Nukleosiden gehörenden Ribosen.
Die Nukleinbasen Uracil, Uridin und Cytidin lassen sich im COSY identifizieren, da die Wasserstoffatome der Basen miteinander koppeln. Die Signale von Uracil liegen bei 7,52ppm und 5,78ppm. Die gebundene Ribose verschiebt die Resonanzfrequenzen der Base im Uridin zu 7,83ppm und 5,96ppm. Die Signale des Cytidins liegen mit 7,86ppm und 6,09ppm nahe bei denen des Uridins, was durch strukturelle Ähnlichkeiten bedingt ist. Dementsprechend sind die Signale des Cytosins bei 7,58ppm und 6,02ppm nahe bei denen des Uracil zu finden.
Pseudouridin ist ebenfalls in diesem Bereich zu finden. Allerdings handelt es sich in diesem Fall um eine Kopplung zwischen dem Signal der Base bei 7,64ppm und dem Signal des α -Wasserstoffs der Ribose bei 4,68ppm. Da die Ribose in diesem Fall über ein Kohlenstoffatom an die Base gebunden ist, ist diese Kopplung möglich.
ppm (t2)6.50 6.00 5.50 5.00 4.50
7.00
7.50
8.00
8.50
ppm (t1) Uridin
Uracil
Cytidin
Pseudouridin Cytosin
ppm (t2)6.50 6.00 5.50 5.00 4.50
7.00
7.50
8.00
8.50
ppm (t1) Uridin
Uracil
Cytidin
Pseudouridin
ppm (t2)6.50 6.00 5.50 5.00 4.50
7.00
7.50
8.00
8.50
ppm (t1)
ppm (t2)6.50 6.00 5.50 5.00 4.50
7.00
7.50
8.00
8.50
ppm (t1) Uridin
Uracil
Cytidin
Pseudouridin Cytosin
Abbildung 14: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der Nukleinbasen Uracil, Uridin, Cytosin, Cytidin und Pseudouridin.
Die Nukleinbasen der Nukleoside Adenosin und Guanosin, sowie Thymin und Xanthin tragen nur singuläre Protonen, die nicht mit anderen Protonen koppeln. Sie können nur mit Hilfe des HSQC identifiziert werden, da ihre Intensität in dem Protonenspektrum so gering ist, dass man sie nicht eindeutig als Signal identifizieren kann.
ppm (t2) 8.50 8.00 7.50
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0
160.0 ppm (t1) Adenosin
Adenosin
Guanosin
Thymin Xanthine
ppm (t2) 8.50 8.00 7.50
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0
160.0 ppm (t1)
ppm (t2) 8.50 8.00 7.50
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0
160.0 ppm (t1) Adenosin
Adenosin
Guanosin
Thymin Xanthine
Abbildung 15: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Nukleinbasen Adenosin, Guanosin, Xanthin und Thymin. Da diese Substanzen nur gering konzentriert sind, ist auch die Intensität der Signale schwach.
Die Resonanzfrequenzen von Dihydrouracil liegen nicht bei denen der anderen Nukleinbasen.
Da Dihydrouracil keine aromatische Struktur besitzt, liegen seine Signale in dem aliphatischen Bereich bei 2,65ppm und 3,43ppm und sind durch viele Überlagerungen nicht einfach zu identifizieren.
3.3.1.2.2. Pyridine
Neben den Purin- und Pyrimidin-Nukleosiden gibt es auch Pyridin-Nukleoside, welche allerdings nicht in RNA oder DNA eingebaut werden. Eines davon konnte in den untersuchten Urinproben identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um 4-Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid. Dieses Nukleosid wurde zuerst im Urin von Leukämie-Patienten gefunden (Dutta et al, 1979). Die genaue Funktion im humanen Stoffwechsel ist bis heute nicht bekannt. Die Konzentrationen im Blut und im Urin sind bei Nierenfunktionsstörungen erhöht. Auch bei AIDS-Patienten wurden höhere Konzentrationen festgestellt (Slominska et al, 2006).
Auch hier ist die Ribose zur Identifizierung nicht geeignet, da sie keine Kopplung zu dem Pyridin-Derivat zeigt und sich ihre Signale in dem überlagerten Bereich befinden. Das 4-Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid ist nur gering konzentriert. Sowohl im Protonenspektrum als auch im HSQC sind die Intensitäten der Signale sehr schwach. Für eine eindeutige Identifizierung ist deshalb das COSY hilfreich. Dort sind die Kopplungssignale von 8,04ppm zu 6,72ppm und zu 8,76ppm zu erkennen.
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1) 4P3C
4P3C
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1)
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1) 4P3C
4P3C
Abbildung 16: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale des 4-Pyridon-3-Carboxamid-1-β -D-Ribonukleosids (4P3C). Die Intensität der Signale ist sehr schwach.
Mit N-Methylnikotinsäure, N-Methylnikotinamid, N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid, Chinolinsäure und 6-Aminonikotinamid konnten weitere Pyrididine im Urin identifiziert werden. Dabei handelt es sich nahezu ausschließlich um Metabolite des Vitamin B3 Stoffwechsels, welches eine Komponente des Coenzyms NAD ist und von über 500 Enzymen benötigt wird. Als Vitamin B3 werden sowohl Nikotinsäure als auch Nikotinamid bezeichnet.
Methylnikotinsäure ist ein Abbauprodukt der Nikotinsäure. Methylnikotinamid und N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid entstehen beim Abbau von Nikotinamid. Sie alle sind Marker im Urin für den Vitamin B3 Status und werden unter anderem bei Nierenschäden oder verschiedenen Tumoren verstärkt ausgeschieden (Okamoto et al, 2003; Carter, 1982;
McCreanor und Bender, 1986).
Chinolinsäure entsteht beim Abbau von Tryptophan und wird zu Nikotinamid weiterverarbeitet. Die Säure im Urin kann als Biomarker für juvenile, idiopathische, phlogistische Myopathie herangezogen werden. Im Fall dieser entzündlichen Muskelerkrankung ist die Konzentration der Chinolinsäure im Urin um das Zwei- bis Dreifache erhöht (Rider et al, 2002).
Daneben gibt es noch ein Pyridin-Derivat, welches als 6-Aminonikotinamid identifiziert wurde. 6-Aminonikotinamid wird in der Krebstherapie eingesetzt. Im Urin gesunder Individuen wurde es bisher nicht beschrieben. Eventuell wird es über die Nahrung aufgenommen und unverarbeitet wieder ausgeschieden.
N-Methylnikotinsäure und N-Methylnikotinamid sind einfach zu identifizieren. Einige ihrer Resonanzfrequenzen liegen im Protonenspektrum gegenüber allen anderen Signalen tieffeldverschoben bei 9,09ppm bzw. 9,26ppm. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls unproblematisch, da hier keine Überlagerungen zu finden sind. Auch eine Resonanzfrequenz von N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid liegt sehr weit tieffeldverschoben bei 8,26ppm und ist für analytische Zwecke geeignet. Chinolinsäure zeigt ebenfalls in diesem Bereich ein Signal bei 8,62ppm, welches nicht überlagert ist. Lediglich die Resonanzfrequenz von 6-Aminonicotinamid bei 8,53ppm ist überlagert.
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
N-Met-NA
N-Met-NS
N-Met-NA
N-Met-NS
ChS 2P5C
ANA
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
N-Met-NA
N-Met-NS
N-Met-NA
N-Met-NS
2P5C
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
N-Met-NA
N-Met-NS
N-Met-NA
N-Met-NS
ppm (t1) 9.00 8.50 8.00
N-Met-NA
N-Met-NS
N-Met-NA
N-Met-NS
ChS 2P5C
ANA
Abbildung 17: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der enthaltenen Pyridin-Derivate. Abkürzungen: Met-NS – Methylnicotinsäure, Met-NA – Methylnicotinamid, 2P5C – N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid, ChS – Chinolinsäure, ANA – 6-Aminonicotinamid.
Alle Pyridin-Derivate besitzen Resonanzfrequenzen, die im Protonenspektrum weit tieffeldverschoben sind. Die dazugehörenden Kohlenstoffe geben ebenfalls stark tieffeldverschobene Signale bei über 140ppm. Dadurch sind diese Derivate auch im HSQC leicht zu identifizieren.
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1) 4P3C
4P3C
N-Met-NS N-Met-NA
ChS ANA
2P5C N-Met-NA N-Met-NS
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1) 4P3C
4P3C
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1)
ppm (t2) 9.00 8.50 8.00
130.0
135.0
140.0
145.0
150.0
155.0 ppm (t1) 4P3C
4P3C
N-Met-NS N-Met-NA
ChS ANA
2P5C N-Met-NA N-Met-NS
Abbildung 18: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der enthaltenen Pyridin-Derivate.
Abkürzungen: N-Met-NS – N-Methylnicotinsäure, N-Met-NA – N-Methylnicotinamid, 2P5C – N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid, ChS – Chinolinsäure, ANA – 6-Aminonicotinamid, 4P3C – Pyridon-3-Carboxamid-1-β -D-Ribonukleosid.
3.3.1.2.3. Indole und Imidazole
Außerdem konnten verschiedene Indole und Imidazole identifiziert werden. Tryptophan, Histidin und zwei Histidin-Derivate werden bei den proteinogenen Aminosäuren (Kapitel 3.3.2.) erwähnt.
Imidazolessigsäure ist ein Metabolit von Histidin und Histamin (Khandelwal et al, 1985), welches selber ein Decarboxylierungsprodukt von Histidin und einer der bekanntesten Mediatoren allergischer Entzündungen ist. Im Falle einer Histidinämie oder einer erhöhten Histaminausschüttung wird Imidazolessigsäure vermehrt ausgeschieden.
Indolessigsäure und Indoxylsulfat sind Abbauprodukte der essentiellen Aminosäure Tryptophan. Phenylketonurie führt zu einer erhöhten Ausscheidung von Indolessigsäure im Urin. Das Hartnup-Syndrom (autosomal-rezessiv erblicher Transportdefekt für Monoamino-Monocarboxylsäuren in Nieren und Dünndarm) führt zu einer vermehrten Ausscheidung u. a.
von Inolessigsäure und Indoxylsulfat. Hohe Konzentrationen von Indoxylsulfat im Urin stehen auch in Beziehung mit einer schnellen Entwicklung von chronischem Nierenversagen (Niwa et al, 1999).
5-Hydroxyindolacetat ist ein Abbauprodukt von Serotonin, einem Neurotransmitter im Gehirn. Eine vermehrte Ausscheidung von 5-Hydroxyindolacetat ist ein Hinweis auf neuroendokrine Tumore, von denen viele Serotonin produzieren (Zuetenhorst et al, 2004).
führt ebenfalls zu einer erhöhten 5-Hydroxyindolacetat-Konzentration im Urin. Auch die Einnahme diverser Medikamente (z. B.: Diazepam, Naproxen, Aspirin) kann die Ausscheidung von 5-Hydroxyindolacetat verändern. Um 5-Hydroxyindolacetat im Urin als Marker für Tumore verwenden zu können, dürfen diese Lebensmittel und Medikamente zwei Tage vor der Urinuntersuchung nicht mehr konsumiert werden. Ansonsten kann es sowohl zu falsch positiven als auch falsch negativen Ergebnissen kommen (Feldman et al, 1985).
Die Resonanzfrequenzen von Imidazolen sind sehr stark vom pH-Wert abhängig. Für einige Fragestellungen sind reproduzierbare Ergebnisse wichtig. Um diese zu erhalten, ist es wichtig, den pH-Wert der Proben genau einzustellen. Bei dem für diese Untersuchungen gewählten pH-Wert von 5,85 liegen die Signale der Protonen weit tieffeldverschoben über 8,4ppm. Die dazugehörenden Kohlenstoffe liegen um 135ppm. Das ermöglicht eine Unterscheidung von Pyrimidinen und Imidazolen im HSQC-Spektrum.
Die Resonanzfrequenzen von Imidazolacetat liegen nahe bei denen der Aminosäure Histidin und seiner Derivate. Dies ist durch strukturelle Gemeinsamkeiten begründet. Die Signale der aliphatischen Seitenkette liegen in dem Bereich starker Überlagerungen und sind für analytische Zwecke nicht geeignet. Die Signale des Imidazolrings liegen bei 8,53ppm und 7,2ppm.
ppm (t1)8.50 8.00 7.50
IA
IA
ppm (t1)8.50 8.00 7.50
IA
IA
Abbildung 19: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale des Imidazolacetats (IA).
Die Intensität der Signale ist sehr schwach.
Indol-Derivate die in der 2. oder 3. Position substituiert sind, weisen sehr ähnliche Strukturen auf. Dementsprechend dicht liegen ihre Resonanzfrequenzen beieinander. Die Signale von Indoxylsulfat, Indolessigsäure und einem weiteren Indol-Derivat, Tryptophan (siehe 3.3.2.2.
aromatische Aminosäuren) überlagern sich und sind im Protonenspektrum nicht auseinander zu halten. Im COSY-Spektrum zeigen die Signale der Indol-Derivate ein charakteristisches Kopplungsmuster. Aber auch hier ist zu erkennen, dass die Signale sich überlagern.
Indole
ppm (t2)7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
7.30
7.40
7.50
7.60
7.70
7.80
7.90 ppm (t1) Indole
ppm (t2)7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 7.00 6.90 6.80
7.30
7.40
7.50
7.60
7.70
7.80
7.90 ppm (t1)
Abbildung 20: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Kopplungssignale der Indol-Derivate.
Aufgrund der strukturellen Gemeinsamkeiten kommt es zu Überlagerungen der Signale.