Probleme der Metagenomik

3.1. Heterologe Expression der gefundenen Metagenomenzyme

Bei beiden in dieser Arbeit beschriebenen Enzymen traten Probleme auf, wie sie bei der heterologen Expression von Metagenomenzymen häufig zu Tage treten. Es kam in beiden Fällen zur Bildung von unlöslichen Einschlusskörpern, was jedoch kein spezifisches Problem von Metagenomenzymen ist, sondern bei heterologer Expression in Wirten wie E. coli häufig auftritt (Baneyx und Mujacic, 2004). Während sich das Problem bei EstCE durch die Wahl eines anderen Expressionssystemes leicht beheben ließ, war dies bei der Lipase LipCE nicht der Fall.

Von extrazellulären Pseudomonas-Lipasen ist bekannt, dass sie spezielle Faltungshelfer und Sektretionssysteme benötigen. Die Sekretion in P. aeruginosa beispielweise erfolgt über einen TypII-Sekretionsmechanismus. Signalpeptidabhängig erfolgt der Export dort durch die Xcp-Maschinerie, welche aus insgesamt zwölf

Komponenten besteht (Filloux et al., 1998). Zudem sind spezielle Faltungshelfer (Foldasen) nötig (Jäger et al., 1994). Gleiches gilt zum Beispiel für Lipasen aus B. glumae (Frenken et al., 1993) oder P. alcaligenes (Gerritse et al., 1998).

Ein zweites System ist der ABC-abhängige Transport, die TypI-Sekretion (Binet et al., 1997). Dies besteht nur aus drei Komponenten, einer ATPase (ABC-Protein), einem Membranfusionsprotein und einem Protein in der äußeren Membran. Im Gegenteil zu den N-terminalen Signalpeptiden der Typ-II-Sekretion, weisen auf diesem Weg exportierte Proteine C-terminale Erkennungssequenzen auf. Die meisten Lipasen der Famile I.3, zu denen viele P. fluorescens-Lipasen zählen, werden auf diesem Wege sekretiert (Arpigny und Jäger, 1999). Auch LipCE lässt sich aufgrund der Sequenzhomolgie und des Vorhandenseins dieser C-terminalen Sekretionssignale (III.4.1.3) zweifelsfrei in die Familie I.3 eingruppieren. Von mehreren P. fluorescens-Lipasen ist bekannt, dass sowohl Lipase als auch die drei Komponenten des ABC-Transporters in einem Operon organisiert vorliegen. Der Transporter ist sehr spezifisch für diese Lipase, z.T. werden auch Proteasen (Duong et al., 1994) oder Komponenten des S-Layers (Kawai et al., 1998) hierdurch sekretiert. Es existieren verschiedene Operonstrukturen, denen gemeinsam ist dass sich die Lipase stromabwärts des ABC-Transporters befindet. Stromaufwärts davon finden sich in der Regel eine alkalische Protease, die ebenfalls von diesem System sekretiert wird, sowie deren Inhibitor. In verschiedenen P. fluorescens-Isolaten unterscheidet sich dieses Operon dadurch, dass bis zu zwei weitere Gene mit Homologie zu Serinproteasen zwischen Lipase und ABC-Transporter liegen. In keinem der gezeigten Fälle (Abb. 57) konnte diesen Genen jedoch eine Aktivität nachgewiesen werden. Auch auf pCosCE2 fand sich eins dieser Gene, jedoch ebenfalls ohne Protease-Aktivität. Die Operonstrukturen der Gene in verschiedenen P. fluorescens-Stämmen ist in Abbildung 57 gezeigt. Abweichend davon ist die Anordnung in Serratia marcescens, wo sowohl Lipasegene als auch der zugehörige ABC-Transporter hohe Homologie zu P. fluorescens aufweisen, jedoch auf dem Chromosom voneinander getrennt sind (Akatsuka et al., 1995). Die hohe Sequenzhomolgie von LipCE zu den P. fluorescens-Lipasen aus SIK W1, B52 oder no.

33 spricht dafür, dass diese Operonstruktur auch in diesem Fall vorliegt, bei der Cosmidbankerstellung wurde dieser in 5’-Richtung liegende Teil jedoch getrennt.

Abb. 57: Operonstrukturen von Familie I.3-Lipasen und deren spezifischen ABC-Transportern in verschiedenen P. fluorescens-Stämmen sowie S. marcescens.

Homologe Gene sind identisch gefärbt, die verschiedenen Namen für die jeweiligen Stämme übernommen. Dunkelblau: alkalische Protease, hellgrün: Proteaseinhibitor, hellblau: ABC-Transporter (1. Gen: ABC-Protein, 2. Gen: Membranfusionsprotein, 3. Gen: Protein der äußeren Membran), gelb: Serinprotease-Homologe, rot: Lipase. pCosCE2 wurde bei Erstellung der Cosmidbank getrennt (hellblauer Pfeil).

Obwohl viele ähnliche P. fluorescens-Lipasen bekannt sind, gelang bei keiner dieser Lipasen die heterologe Expression in E. coli bei alleiniger Expression des Lipasegens.

Stets war die Bildung unlöslicher Einschlusskörper die Folge (Chung et al., 1991;

Kojima und Shimizu, 2003; Kim et al., 2005; Luo et al., 2006). Erst die gleichzeitige Co-Expression der drei Gene für den ABC-Transporter ermöglichte in E. coli die Sekretion aktiven Proteins in den Kulturüberstand (Ahn et al., 1999; Kawai et al., 1999). Auch bei heterologer Expression in anderen Pseudomonas sp. gelang so die Sekretion (Ahn et al., 2001). P. aeruginosa, der ein TypI-Sekretionssystem besitzt (Stover et al., 2000) war als Wirt nicht in der Lage, LipCE zu sekretieren [III.4.4.2]. Das P. aeruginosa-System ist scheinbar zu speziell und sekretiert nur die alkalische Protease (Guzzo et al., 1991), ein Hämbindeprotein (Letoffe et al., 1998) sowie AprX, dessen Funktion nicht bekannt ist (Duong et al., 2001).

Die Co-Expression wäre eine zukünftige Option für die Expression von LipCE, da sich die Reinigung aus dem Kulturüberstand wesentlich leichter gestaltet als die Rückfaltung aus Einschlusskörpern. Dadurch würde sich auch die Attraktivität des Enzyms hinsichtlich seiner Verwendung erhöhen, da die Zugänglichkeit eines Enzyms

unter den Aspekten biotechnologischer Anwendbarkeit ein wichtiger Parameter ist (Lorenz und Eck, 2005).

3.2. Alternative Expressionssysteme für die Metagenomik

Um die oben geschilderten Probleme bei der heterologen Produktion von Exoenzymen oder auch die allgemeinen Probleme wie Transkription der Gene, fehlende Erkennung der Promotoren, korrekte Proteinfaltung oder posttranslationale Modifikationen zu umgehen, ist die Entwicklung neuer Wirts- und Expressionssysteme notwendig. Erste Ansätze mit der Expression von Metagenombanken in Wirten wie Streptomyces lividans (Wang et al., 2000) oder Pseudomonas putida (Martinez et al., 2004) zur Expression von Sekundärmetaboliten (Antibiotika) wurden bereits erfolgreich unternommen, stellen bislang jedoch die Ausnahme dar. Da jedoch davon auszugehen ist, dass in E. coli 60% aller Fremdgene gar nicht exprimiert werden (Gabor et al., 2004), geht immer noch ein immenses Potential ungenutzt verloren.

Insbesondere für die Produktion von Exoenzymen wie z.B. der Lipase LipCE sollte verstärkt der Einsatz alternativer Wirte vorangetrieben werden, die über alternative Sekretionssysteme zu E. coli verfügen. In Frage kämen dafür Bacillus-Arten, Streptomyces-Arten oder Rhizobien, aber auch eukaryotische System wie Hefen, die über viele Lipasen verfügen. Für diese Organismen stehen meist bereits etablierte genetische Systeme zur Verfügung. Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang die heterologe Expression zweier Metagenomlipasen in der Hefe Pichia pastoris (Jiang et al., 2006). Beide weisen hohe Ähnlichkeit zu LipCE auf (85%) und anderen P.

fluorescens-Enzymen der Familie I.3 auf. Hier konnten diese Enzyme erstmalig unter Verwendung der natürlichen Systeme des Wirtes ohne Co-Enzyme aktiv heterolog exprimiert und sekretiert werden, ein für Lipasen vielversprechender Ansatz.