• Keine Ergebnisse gefunden

IV. Diskussion

5. Biochemische Charakterisierung der Enzyme

5.7. Einfluss von Co-Faktoren

Ein klassisches Merkmal von Lipasen und Esterasen ist deren Unabhängigkeit von Co-Faktoren. Die meisten Enzyme weisen unabhängig von Co-Faktoren optimale Aktivitäten auf. Steigernde Effekte wurden in der Regel mit bivalenten Kationen wie Calcium und Magnesium beobachtet, wobei Calcium die wichtigste und häufig eine stabilisierende Rolle spielt (Jäger et al., 1999; Gupta et al., 2004).

Für EstCE gilt in diesem Zusammenhang, dass es wie viele Lipasen von Kationen als auch Detergenzien kaum beeinflusst wird [III.2.7.7]. Einzig EDTA wirkte etwas stimulierend mit einer Aktivitätszunahme von 20%, während Ca2+ oder Mg2+ keinen nennenswerten Einfluss hatten. Fe3+, Fe2+ und Cu2+ inhibierten die Enzymaktivität, was auf deren stark oxidierende Wirkung zurückzuführen sein wird, die eine Vielzahl an Enzymen unspezifisch hemmen.

5.7.1. LipCE und der Einfluss von Calcium

Von den getesteten Kationen bewirkte einzig Ca2+ einen stimulierenden Effekt. Wie bei EstCE wurde LipCE durch Fe3+, Fe2+ und Cu2+ inhibiert und tolerierte viele der getesteten Lösungsmittel in Konzentrationen von 15% (v/v) [III.4.4.7]. In Gegenwart von 1 mM Ca2+ wurde ein stark stimulierender und stabilisierender Effekt beobachtet [III.4.4.8]. Bei initialen Messungen mit Rohextrakten wurde ein 6facher Anstieg der Aktivität in Gegenwart von 5mM Ca2+ gefunden, während der Effekt bei reinem Protein wesentlich drastischer ausfiel. Bei 20°C konnte die Reaktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Ca2+ bis zu 88fach gesteigert werden, während der Effekt bei 0°C noch etwa 20fach war [III.4.4.8]. Ähnliche Abhängigkeiten sind für die Lipasen PML aus Pseudomonas sp. MIS38, ebenfalls eine Lipase der Familie I.3 (Amada et al., 2001)

und die Lipase SHL aus Staphylococcus hyicus (Simons et al., 1999) bekannt. Hier zeigen geringere Konzentrationen von Ca2+ bereits wesentliche Steigerungen der Aktivität bzw. der Reaktionsgeschwindigkeit, während bei LipCE erst ab einer Konzentration von 1 mM ein sprunghafter Anstieg der Reaktionsgeschwindigkeit zu beobachten war (Abb. 62).

Andere Beispiele zeigen hingegen weniger starke Einflüsse von Ca2+ auf die Lipaseaktivitäten. 6fache Steigerungen werden für die nahe verwandten P.

fluorescens-Lipasen aus SIK W1 (Lee et al., 1993) und KB700A (Rashid et al., 2001) berichtet. Stabilisierende Effekte von Ca2+ auf das Enzym werden auch für die SIK W1-Lipase berichtet, wo die Stabilität gegenüber Guanidin-HCl, DMSO und Trifluorethanol zunimmt (Kim et al., 2005). LipCE zeigte in Gegenwart von Ca2+ eine gesteigerte Stabilität gegenüber Hitzedenaturierung, was auch von Lipasen aus Acinetobacter sp.

RAG-1 (Snellman et al., 2002), A. calcoaceticus AAC323-1 (Bompensieri et al., 1996), P. fluorescens M50 (Swaisgood und Bozoglu, 1984) oder Staphylcoccus hyicus (Simons et al., 1999) bekannt ist.

Abb. 62: Abhängigkeit verschiedener Lipaseaktivitäten von der Ca2+-Konzentration Für die Lipase PML aus P. sp. MIS38 ist die Aktivität angegeben, für SHL aus Staphylococcus hyicus und LipCE wurden vmax bzw. v0 in Anhängigkeit von der Ca2+-Konzentration ermittelt. Die Werte für PML (Amada et al., 2001) wurden nur bis 1mM angegeben.

Zurückzuführen ist dieses Phänomen auf eine Stabilisierung des Enzyms, die mit Veränderungen in der Sekundärstruktur einhergehen. Für LipCE konnte dies anhand CD-spektroskopischer Untersuchungen gezeigt werden [III.4.4.10].

Dies gilt auch für die SIK W1-Lipase. Hier halbierte sich in Anwesenheit von Ca2+ der Anteil ungeordneter Strukturen (random coil) von 66,8% auf 32,5%, während der Anteil von β-Faltblättern und α-Helices stark zunahm (Kim et al., 2005). Für LipCE lässt sich

ähnliches vermuten, allerdings stehen Verfeinerungen der CD-Spektren noch aus, so dass der Anteil an Sekundärstrukturelementen genauer bestimmt werden kann.

Für die Bindung des Calciums werden in den Familie I.3-Lipasen C-terminal gelegene, glycinreiche Ca2+-Bindemotive verantwortlich gemacht. Dies wurde zunächst durch Deletionsstudien an den Lipasen aus P. fluorescens HU380 (Kojima et al., 2003) und P. sp. MIS38 (Amada et al., 2001) gezeigt. Diese Ca2+-Bindemotive der allgemeinen Sequenz GGxGxDxux (x, beliebige AS, u hydrophobe AS) finden sich auch in LipCE (AS 382-399). Zudem sind diese Motive auch als Erkennungssignale in den ABC-abhängigen TypI-Sekretionsmechanismus involviert (Kwon et al., 2002). Aus der Kristallstruktur der alkalischen Protease aus P. aeruginosa, die über einen TypI-Sekretionsmechanismus sekretiert wird und auch über Ca2+-Bindemotive verfügt, ist bekannt, dass die Ca2+-Bindung in einer sogenannten β-Rolle stattfindet (Baumann et al., 1993). Hierbei bilden wenigstens fünf repetitive Sequenzen aus neun AS eine Rolle, in der die jeweils ersten sechs AS einen Loop und die nächsten drei ein β-Faltblatt bilden. In den äußeren Enden dieser Rolle werden die Ca2+-Ionen gebunden und bewirken damit auch die stabile Struktur dieses C-terminalen Teils (Abb. 63A).

Aufgrund der hohen Ähnlichkeit dieser Sequenz zwischen LipCE, MIS38 und auch der alkalischen Protease ist es wahrscheinlich, dass diese Struktur sich auch am C-terminalen Ende von LipCE findet, wie es bereits für das MIS38-Protein postuliert wurde (Angkawidjaja et al., 2005). Durch ein Modellieren der C-terminalen 108 Reste von LipCE mittels SWISS-Model (Kopp und Schwede, 2006) wird für LipCE ebenfalls eine Rollenstruktur hervorgesagt (Abb. 63B, C). Die Vorhersage wurde aufgrund hoher Ähnlichkeit zu der Struktur des C-Terminus einer sekretierten, Ca2+-abhängigen Mannuronan-C-5-Epimerase aus Azotobacter vinelandii erstellt (Pdb-Eintrag 2agm), welche an bekannten Strukturen die größte Ähnlichkeit für den untersuchten Bereich aufwies (Aachmann et al., 2006). Auch in diesem Modell würde das Ca2+-Ion von nach innen ragenden Aspartatresten komplexiert werden können. Am Beispiel der MIS38-Lipase konnte durch Mutagense der Reste Asp387 und Asp396, die auch in LipCE konserviert sind, deren Bedeutung für die Ca2+-Bindung nachgewiesen werden (Angkawidjaja et al., 2005).

Abb. 63: Struktur der C-terminalen β-Rolle der alkalischen Protease aus P. aeruginosa und vorhergesagte Struktur für LipCE

A) Seitenansicht der Struktur der β-Rolle der alkalischen Protease aus P. aeruginosa mit gebundenen Ca2+-Ionen (aus Angkawidjaja et al., 2005). B) Vorhersage der Struktur des C-terminalen Bereichs (AS371-476) von LipCE anhand von Vergleichen mit dem C-Terminus der Mannuronan-C-5-Epimerase aus A. vinelandii (Aachmann et al., 2006). β-Faltblätter sind als Pfeile dargestellt. C) Seitenansicht in die β-Rollenstruktur von LipCE. Ansicht B und C erstellt mittels SWISS-Model (Kopp und Schwede, 2006) und RasMol (Sayle und Milnar-White, 1995).

6. Microarray-Entwicklung zur Detektion neuer Lipasen