Probiotika und Competitive exclusion (CE)

Probiotika

Probiotika sind lebende, mikrobielle Zusatzstoffe, die die Darmflora in einem für das Wirtstier positiven Sinne beeinflussen. Sie bestehen aus einem oder wenigen, genau definierten Mikroorganismus-Stämmen (WHO 1994). Am häufigsten werden Spezies aus den Genera Lactobacillus und Enterococcus verwendet (KLEIN 2000).

Für Probiotika werden allgemein verschiedene Wirkungsmechanismen angenommen: die Erzeugung von kurzkettigen Fettsäuren, die als Hemmstoffe zu einer pH-Wert-Absenkung führen, sowie weiteren Substanzen, die gegen andere Mikroorganismen einen Selektionsvorteil bieten, ohne die gewünschte Darmflora zu unterdrücken. Ferner wird die Verdrängung bzw. Verhinderung des Anheftens potentiell pathogener Keime an der Darmschleimhaut diskutiert. Auch eine Hemmung bei der Bildung mikrobieller Toxine, die Stimulierung des lokalen Immunsystems im Darm oder die Beeinflussung der physikochemischen Verhältnisse im Darm, wie pH-Wert und Redox-Potential sowie die Beeinflussung des Gallen-säureabbaus und damit Unterstützung der Fettabsorption werden angenommen.

Zusätzlich wird eine Beeinflussung des Darmepithels sowie eine Verbesserung der Absorptionskapazität vermutet (AWT 1999).

So konnte nach Verabreichung geflügelspezifischer Probiotika an Hühner (PASCUAL et al. 1999) und an Broiler (TELLEZ et al. 2001) eine deutliche Herabsetzung der Besiedlung mit S. Enteritidis nachgewiesen werden.

Nicht immer können durch die Verwendung von Probiotika zusätzliche Effekte erzielt werden (JOHANNSEN et al. 2004; PRIYANKARAGE et al. 2004). Dies könnte mit der unterschiedlichen Ausgangssituation bezüglich der mikrobiellen Besiedlung im Verdauungstrakt im Zusammenhang stehen (AWT 1999).

Competitive exclusion (CE)

Da intensiv aufgezogenes Junggeflügel nur langsam die komplexe intestinale Mikroflora älterer Vögel entwickelt, neigt es besonders zur Kolonisation mit Salmonellen (BARROW et al. 2003). Durch die Verabreichung von Mikroorganismen der Darmflora adulter Tiere an junge Tiere soll ein Schutz gegen pathogene kolonisierende Mikroorganismen übertragen werden. Dieses Verfahren wurde bereits 1992 von NURMI et al. bei der Bekämpfung der Salmonelleninfektion des Huhnes angewandt und mit der Bezeichnung „Competitive exclusion“ (CE) beschrieben.

Kommerzielle CE-Produkte enthalten eine große Anzahl an verschiedenen, nicht genau definierten Keimen, die in der Regel aus dem Inhalt des Caecums adulter Spendertiere stammen. Ihre exakte Zusammensetzung ist i. d. R. unbekannt. Sie müssen jedoch vor Anwendung auf die Abwesenheit aller bekannten geflügel- und humanpathogenen Keime getestet werden (SELBITZ et al. 1995; BARROW et al.

2003). CE-Produkte definierter Zusammensetzung sollen weniger wirksam sein (STAVRIC u. D’AOUST 1993).

Der genaue Mechanismus des inhibitorischen Effektes von CE-Produkten gegenüber der Kolonisation mit Salmonellen ist unbekannt. Für die Schutzwirkung sollen mehrere Mechanismen verantwortlich sein: die Konkurrenz um Nährstoffe und bei der Adhäsion an die Mukosa, ein geringes Redoxpotential, die Produktion von

Schwefelwasserstoff sowie die Bildung von antibakteriellen Substanzen wie kurzkettige Fettsäuren und Bacteriocine (NURMI et al. 1992; BARROW et al. 2003).

Viele unter Laborbedingungen durchgeführte Studien (HINTON et al. 1990; ZIPRIN et al. 1990; CORRIER et al. 1991) sowie eine Feldstudie in Schweden (WIERUP et al. 1992) haben eine gewisse Wirksamkeit der CE-Anwendung gegen Salmonellen-Infektionen bestätigt, jedoch stellt sich nur selten ein kompletter Schutz ein (MEAD 2000).

Nach Verabreichung einer CE-Flora soll die zusätzliche Gabe von Laktose zum Futter zu einer Senkung des pH-Wertes im Caecum bei einer gleichzeitigen Erhöhung des Gehaltes an flüchtigen Fettsäuren führen. Dadurch wiederum soll die Kolonisierung mit S. Typhimurium gehemmt werden (OYOFO et al. 1989; CORRIER et al. 1990).

Während auch Puten gegen eine Infektion mit Salmonellen durch die Verabreichung von CE-Zubereitungen aus Hühnern geschützt werden können sollen (IMPEY et al.

1982), konnte bei Enten bisher noch kein Effekt durch die Übertragung anaerober Kulturen der Darmflora adulter Tiere auf Jungtiere gezeigt werden (HENRY 2000).

2.2.3.3 Therapie

In der EU wird das Ziel angestrebt, die Prävalenz der zoonotisch bedeutsamen Salmonellen in den Geflügelbeständen zu senken (VO EG Nr. 2160/2003 und Richtlinie 2003/99/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 17. November 2003). Daher kann die Behandlung gegen Salmonellen nur eine Notmaßnahme sein.

Prinzipiell wäre eine Therapie mit einer Vielzahl von Antibiotika und Chemotherapeutika möglich. Salmonellen in Großbritannien zeigen eine gute in vitro

Sensitivität gegen Amoxycillin, Chloramphenicol, Colistin, Enrofloxacin, Neomycin, Spectinomycin, Streptomycin, Tetrazykline und Trimethoprim (HENRY 2000). Die Anwendung von Chloramphenicol ist jedoch verboten und Neomycin und Colistin werden kaum resorbiert, weshalb sie sich zur Therapie einer extraintestinalen Infektion kaum eignen. Enrofloxacin wurde teilweise erfolgreich zur Elimination von S. Enteritidis in Enten-Elterntierherden eingesetzt (HENRY 2000).

Welche Antibiotika und Chemotherapeutika zugelassen sind, hängt von den rechtlichen Bestimmungen der einzelnen Staaten ab (HENRY 2000; BARROW et al.

2003). Da in Deutschland derzeit jedoch kein ausdrücklich für die Ente, gegen Salmonellen wirksames, zugelassenes Antibiotikum bzw. Chemotherapeutikum auf dem Markt ist, käme eine Anwendung im Therapienotstand nur nach Umwidmung infrage (UNGEMACH 2003). Dieses würde für die Ente nach § 12a der Tierärztlichen Hausapotheken-Verordnung eine Mindestwartezeit von 28 Tagen für essbare Gewebe nach sich ziehen und ist somit für Enten-Mastherden in der Regel nicht praktikabel. Bei einer heute teilweise üblichen Mastdauer von 42 Tagen wäre der Einsatz von Antibiotika längstens bis zum 14. Lebenstag möglich. Die Anwendung kann zudem nur durch empirische Dosisschemata bzw. Dosisextrapolation erfolgen (UNGEMACH 2003), da für die Ente keine Darreichungsformen und Dosierungen in der Zulassung geprüft wurden. Somit sind auch keine minimalen Hemmstoff-konzentrationen (MHK-Werte) bzw. therapeutische Level bekannt.

Ferner kann ein antibiotisches Vorgehen aus therapeutischen Gründen oder gar als reine Prophylaxemaßnahme nicht als Mittel der Wahl zur Bekämpfung von Salmo-nelleninfektionen angesehen werden, da bereits heute zunehmend Einfach- und auch Mehrfachresistenzen gegenüber gängigen Antibiotika bei Salmonellen beobachtet werden (THRELFALL et al. 1997; HELMUTH 2000; SCHROETER et al.

2004), wie dies auch verschiedene Monitoring-Programme dokumentieren (HELMUTH u. PROTZ 1997; HELMUTH et al. 2004; SCHROETER et al. 2004). So zeigte ein Forschungsvorhaben des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) bereits 2003 eine Prävalenz von Resistenzen bei Isolaten aus Geflügel von ca. 54 % auf.

Insbesondere der massive Einsatz von Chinolonen und Fluorochinolonen seit Mitte der 80er Jahre führte zu einer steigenden Anzahl Resistenzen bei Salmonellen (PIDDOCK et al. 1990; WRAY et al. 1990; OTEO et al. 2000). Dies drückt sich darin aus, dass im Jahre 2000 und 2001 Isolate vom Geflügel durchschnittlich mit etwa 11 % resistent waren, bei S. Hadar mehr als 40 % der Isolate. Im Jahr 2003 lag der Anteil Chinolon-resistenter Isolate vom Geflügel mit 26 % bereits signifikant höher (SCHROETER et al. 2004), eine verminderte Fluorochinolon-Empfindlichkeit lag sogar bei einigen Serovaren vom Geflügel in mehr als 50 % der untersuchten Isolate vor (MALORNY et al. 2003).

2.2.3.4 Immunisierung

Zwischen 1985 und 1990 stieg die Prävalenz von Infektionen mit S. Enteritidis im Menschen markant an. Dieses wurde v. a. mit dem Verzehr von Eiern in Verbindung gebracht (MEYER et al. 1993b; BARROW et al. 2003). Gegenwärtig sind S. Enteritidis und S. Typhimurium zusammen an mehr als 80 % der Erkrankungen des Menschen durch Salmonellen beteiligt, wobei S. Enteritidis die vorherrschende Serovar ist (DORN et al. 2000; ALPERS u. JANSEN 2004; HARTUNG 2004). Bei S. Enteritidis wird der Phagentyp 4 zurzeit am häufigsten sowohl aus dem Menschen als auch aus dem Geflügel isoliert (NASTASI u. MAMMINA 1996; BOONMAR et al.

1998; SCHROETER et al. 2000; BERGHOLD u. KORNSCHOBER 2004; NYGARD et al. 2004). Bei S. Typhimurium dominiert der Phagentyp DT104, gefolgt von DT8 und DT9 in Probenmaterial vom Menschen (SCHROETER et al. 2000), während bei der Pekingente der Phagentyp DT8 deutlich im Vordergrund steht (KÖHLER et al.

1996).

Das gehäufte Auftreten von S. Enteritidis-Infektionen des Menschen, an denen vorwiegend Rohspeisen mit Hühnereiern beteiligt waren, führte im Jahr 1992 auf EG-Ebene zu der Verabschiedung der Richtlinie 92/117/EWG (PITTLER 1993). Die nationale Umsetzung dieser Richtlinie folgte im Jahr 1994 durch den Erlass der

Hühner-Salmonellen-Verordnung (RABSCH 2000). Diese verfolgt das Ziel, die Prävalenz der Salmonellen-Infektionen bei Hühnern zu senken. Die Impfpflicht gegen S. Enteritidis und S. Typhimurium in Aufzuchtbeständen mit mehr als 250 Tieren ist dabei ein wesentlicher Bestandteil.

Während einige wirtsadaptierte Serovaren wie S. Gallinarum beim Geflügel, S. Choleraesuis beim Schwein oder S. Dublin beim Kalb als Krankheitserreger für den jeweiligen Wirt, jedoch in der Regel nicht für den Menschen gelten (BLAHA 1993, SELBITZ et al. 1995; BARROW et al. 2003), sind andere, nicht wirtsadaptierte Serovaren wie S. Enteritidis und S. Typhimurium (SELBITZ et al. 1995) als Zoonoseerreger zu beachten. Daher zielt die Impfung von Geflügel nicht auf die Gesundheit der Tiere oder die Produktivität ab, sondern soll vorrangig dem Schutz der Gesundheit der Bevölkerung dienen (BARROW et al. 2003; EFSA 2004).

Ziel der Impfung gegen Salmonellen ist, die Prävalenz von Salmonellen im Geflügel-bestand abzusenken und einen Abriss der Infektkette von Tier zu Tier und vom Tier zum Menschen zu bewirken (HAHN u. SCHÖLL 1984; LINDE et al. 1996; HAHN 1999; EFSA 2004). Die Besiedlung mit Feld-Salmonellen kann durch Impfungen alleine zwar nicht vollständig verhindert, zumindest aber doch reduziert werden (MEYER et al. 1993a; CSEREP 2001; EFSA 2004; SCHRÖDER et al. 2004; BEHR et al. 2005).

Die Ansprüche, die laut BARROW et al. (2003) an eine ideale Salmonellen-Vakzine gestellt werden, sind die Verhinderung des Krankheitsausbruchs durch die vorherrschenden Salmonellen-Serovaren und deren verwandte Serovaren. Sie soll die Dauer und das Ausmaß der Ausscheidung minimieren, nicht zu symptomlosen Trägern führen, daneben von unerwünschten Nebeneffekten frei sein und die Immunität stimulieren, welche auf die Nachkommen übertragen werden soll. Des Weiteren soll die aktive Immunität auch bei Anwesenheit von maternalen Antikörpern rasch angeregt werden, und der Impfstoff einfach anzuwenden sein. Lebendvakzinen sollen stabil sein und keine Virulenzsteigerung erfahren. Die mit dem Impfstoff

applizierten Stämme sollen von Wildtyp-Stämmen zu unterscheiden sein und nicht ohne weiteres in der Umwelt überleben können.

Während inaktivierte Vakzine nur zu einer humoralen Immunität führen, bewirken Lebendimpfstoffe neben der humoralen auch eine zellvermittelte Immunität (BARROW 2005; BEHR et al. 2005). Diese ist von größerer Bedeutung für den Schutz gegen Salmonellen (SELBITZ et al. 1995; HAHN 1999; BARROW 2005). Oral verabreichte attenuierte Salmonellen-Lebendimpfstoffe bieten den besten Schutz gegen eine Salmonellen-Infektion, besonders wenn große Belastungs- („challenge“-) Dosen verabreicht werden. Dieser bessere Schutz beruht auf der Fähigkeit der Lebendimpfstoffe, eine effektivere zellvermittelte Immunantwort zu stimulieren als inaktivierte Zubereitungen (Totimpfstoffe). Die orale Verabreichung erlaubt den attenuierten Impfstämmen den natürlichen Weg der Infektion zu nutzen, das Antigen den Lymphozyten des darmassoziierten Lymphgewebes zu präsentieren und die Produktion von sekretorischem IgA auf den Mucosa-Oberflächen im Körper zu induzieren (CLARKE u. GYLES 1993).

Die Wirksamkeit von Lebendimpfstoffen (BARROW et al. 1990, 1991; HASSAN u.

CURTISS III 1996, 1997; LINDE et al. 1996) sowie deren Überlegenheit im Vergleich zu Totimpfstoffen (BARROW et al. 1990) ist in einer Vielzahl von Studien beim Huhn nachgewiesen worden. So konnten in einer Studie bei Hühnern (BARROW et al.

1990), die mit Lebendimpfstoffen immunisiert wurden, deutlich weniger und über einen kürzeren Zeitraum Salmonellen nachgewiesen werden, als bei ungeimpften Tieren. Ein gleichzeitig verwendeter Totimpfstoff hatte kaum einen Effekt auf die Ausscheidung des Challenge-Stammes. In einem Wirksamkeitsversuch bei Hühnern (HAHN 1999), in dem vergleichend verschiedene Inaktivatimpfstoffe und ein Lebendimpfstoff geprüft wurden, wurde bewiesen, dass nur der Lebendimpfstoff eine Organmanifestation und Ausscheidung des Infektionsstammes verhindert bzw. im Vergleich mit ungeimpften Kontrollen reduziert. Obwohl für die Ente bisher keine Lebendimpfstoffe zugelassen sind, wurde ihre Wirksamkeit in Feldstudien bereits erfolgreich geprüft (KÖHLER et al. 1996; BEHR et al. 2005). In Anbetracht der

Immunmechanismen und in Folge des intrazellulären Parasitismus der Salmonellen kann man davon ausgehen, dass auch bei der Ente Lebendimpfstoffe effektiver als Totimpfstoffe sein werden (SELBITZ et al. 1995; HENRY 2000).

Die Immunisierung älterer Enten entweder mit dem Totimpfstoff Bovivac^® (Intervet, Großbritannien), der S. Typhimurium-Antigen enthält, oder mit der inaktivierten S. Enteritidis-Vakzine Salenvac^® (Intervet, Großbritannien) soll zwar die Übertragung dieser Salmonellen über das Ei nicht verhindert, jedoch reduziert haben (HENRY 2000).

Die Weitergabe von maternalen Antikörpern über das Ei an die Nachkommen von Hühnern nach Immunisierung mit Lebendimpfstoffen oder avirulenten Stämmen ist vielfach untersucht worden (METHNER et al. 1994, 2002; HASSAN u. CURTISS III 1996; METHNER u. STEINBACH 1997; BARMAN et al. 2005). In einer Studie von HASSAN und CURTISS III (1996) hatten die Hühnerküken von Hennen, die mit einem avirulenten S. Typhimurium-Stamm infiziert waren, nach der Infektion mit einem anderen, virulenten S. Typhimurium-Stamm einen signifikant höheren Antikörper-Titer als die Küken nicht infizierter Hennen. Die Verteilung maternal übertragener Salmonella-Antikörper und deren protektive Wirkung wurde bei Nachkommen von Broilerelterntieren, die mit S. Typhimurium-Lebend- und S. Enteritidis-Inaktivatimpfstoffen vakziniert worden waren, untersucht (METHNER u.

STEINBACH 1997). Die Immunisierung führte zu einer signifikanten Erhöhung der Antikörperkonzentration im Eidotter der Bruteier, sowie im Serum und Jejunum der Küken. Ein erhöhter Antikörpertiter wurde noch am 21. Lebenstag nachgewiesen. Im Infektionsmodell wurde die Wirksamkeit der maternalen Antikörper gegen eine S. Enteritidis-Infektion untersucht. Dabei kam es im Caecum von Nachkommen immunisierter Elterntiere vom 7. bis 21. Lebenstag zu signifikant geringeren Keimzahlen als bei Kontrolltieren. In einer anderen Studie von METHNER et al.

(2002) wiesen die Nachkommen vakzinierter Elterntiere im Vergleich zu den Kontrolltieren nicht immunisierter Elterntiere im Caecum eine reduzierte Keimzahl

des an sie verabreichten Impfstammes auf. Dabei wurde die Wirksamkeit der aktiven Immunisierung durch die reduzierte Impfstammkolonisation nicht beeinträchtigt.

Bei der Ente konnte in kontrollierten Feldversuchen durch die Immunisierung von Pekingelterntieren ab 1987 mit dem für das Huhn bzw. Rind entwickelten S. Typhimurium-Lebendimpfstoff Zoosaloral H bzw. Zoosaloral R „Dessau“® (Impf-stoffwerk Dessau-Tornau) ein starker Rückgang der Salmonellen-Infektionen beobachtet werden (HAHN 1990; MEYER et al. 1993a; KÖHLER et al. 1996).

Später untersuchten KÖHLER et al. (1996) in einer Feldstudie zunächst die Effektivität des für das Huhn entwickelten S. Typhimurium-Lebendimpfstoffes TAD Salmonella vac^®T (LAH, Cuxhaven) zur Bekämpfung der Salmonellen-infektionen bei Pekingenten in Norddeutschland. Hierbei wurden die Entenelterntiere vier und zwei Wochen vor Beginn der ersten Legeperiode (Alter 21. und 23. Lebens-woche) sowie vier und zwei Wochen vor der zweiten Legeperiode (75. und 77. Lebenswoche) mit der doppelten Impfdosis für Hühner von 2 x 10⁸ KbE pro Ente in 1 ml Resuspensionsflüssigkeit subkutan im Nacken vakziniert. Die Vakzination wurde von den Enten weitgehend ohne Nebenwirkungen vertragen. In Kombination mit einer konsequenten Hygiene führte die Impfung in Entenzuchtbetrieben und Elterntierfarmen mit TAD Salmonella vac^® T zu einer Sanierung der latenten S. Typhimurium-Ausscheider, wodurch die Übertragung der Feldstämme von S. Typhimurium mit dem Brutei auf die nächste Kükengeneration und in den Mast-entenbeständen unterbrochen wurde. Die Nachweisrate von S. Typhimurium in den Enteneiern reduzierte sich von 18,4 % vor der Vakzination auf 0,0 % nach der Impfung. TAD Salmonella vac^® T erwies sich auch als effektiv gegen andere Serovaren der Gruppe B. Der Impfstoff war nicht wirksam gegen S. Enteritidis (Gruppe D) und gegen Salmonella-Serovaren der Gruppen C und E. Aufgrund der unzureichenden Kreuzimmunität des S. Typhimurium-Lebendimpfstoffes TAD Salmo-nella vac^®T gegen Infektionen mit S. Enteritidis hatte die Vakzination keine vollständige Eliminierung der latenten Ausscheider von S. Enteritidis zur Folge.

Laut KÖHLER et al. (1996) weisen der regelmäßige Nachweis von S. Enteritidis PT 4 in Enten und in Brutstaubproben sowie vereinzelte Befunde in Enteneiern auf vertikal von den Zuchtenten bzw. von der Brüterei ausgehende Infektionsketten hin, die auch nach Einführung der Elterntierimpfung mit S. Typhimurium-Lebendimpfstoff TAD Sal-monella vac^® T nicht unterbrochen werden konnten. Dagegen kommt es nach Vakzination von Hühnern mit einem S. Typhimurium-Lebendimpfstoff zu einer teil-weisen Kreuzimmunität auch gegenüber der Infektion mit S. Enteritidis (VIELITZ et al. 1992; MEYER et al. 1993a, LINDE et al. 1996; HASSAN u. CURTISS III 1997).

Somit sind laut KÖHLER et al. (1996) zur Bekämpfung der S. Enteritidis- und S. Typhimurium-Infektionen auf jeden Fall Impfstoffe gegen beide Erreger erforder-lich.

Wegen der zunehmenden Belastung der Pekingenten mit S. Enteritidis wurde 1996 die S. Enteritidis-Lebendvakzine TAD Salmonella vac^® E (LAH, Cuxhaven) zunächst bei Mastenten einer akut erkrankten Mastentenherde getestet (KÖHLER et al. 1996).

Nach der parenteralen Immunisierung - subcutan im Nacken - am 14. und 28. Lebenstag traten in der Vakzinationsgruppe im Gegensatz zu der Kontrollgruppe keine durch S. Enteritidis hervorgerufenen Erkrankungen oder Todesfälle auf. Zum Zeitpunkt der Schlachtung am 45. Lebenstag hatte sich im Organnachweis der Anteil der mit S. Enteritidis infizierten Tiere in der geimpften Versuchsgruppe auf 2 % reduziert, während die ungeimpfte Kontrollgruppe eine Infektionsrate von 32 % aufwies. Drei Wochen nach der Immunisierung mit TAD Salmonella vac^® E redu-zierte sich die Nachweisrate von S. Enteritidis in Kloakentupferproben der geimpften Mastenten auf 0,25 % im Verhältnis zu 4,80 % in der nichtvakzinierten Kontroll-gruppe.

In einer Zuchtentenherde konnten nach der Vakzination mit TAD Salmonella vac^® E keine S. Enteritidis-Feldisolate in Kloakentupferproben nachgewiesen werden. Die Immunisierung von zwei Zuchtentenherden im Rahmen der klinischen Erprobung von TAD Salmonella vac^® E hatte innerhalb von zwei Monaten zu einer einschneidenden Reduzierung der S. Enteritidis-Infektionen auch in den davon abstammenden

Mastentenherden geführt. Die kombinierte Immunisierung mit TAD Salmonella vac^® E und TAD Salmonella vac T bei Zuchtenten erwies sich somit wirksam bei der Eliminierung latenter Salmonellen-Infektionen im Bestand und führte damit zur Verhinderung der Übertragung von S. Typhimurium und S. Enteritidis an die Nach-kommen. (KÖHLER et al. 1996).

Die Vakzination von Enten-Eintagsküken zur Prävention von S. Enteritidis- oder S. Typhimurium-Infektionen wurde bisher nicht untersucht (HENRY 2000).