Nachweis von Salmonellen in verschiedenen Organen .1 Methodische Verfahrensweise

Die ersten Untersuchungen des Caecuminhaltes fanden bei Tieren im Alter von 8 Tagen statt. Zu diesem Zeitpunkt und im Laufe einer guten weiteren Woche war das Caecum noch relativ klein, so dass in der Regel Einwaagen zwischen 0,2 und 0,25 g für die quantitativen Untersuchungen zur Verfügung standen. Die Höhe der Einwaage mit etwa 0,25 g wurde im weiteren Verlauf auch bei älteren Tieren beibehalten, um alle Proben gleich zu behandeln.

Für die Isolierung von Salmonellen wurde als Selektivnährboden BPLS-Agar verwendet, der neben dem XLD (Xylose-Lysin-Desoxycholat)-Agar in der „Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG“ (L 00.00-20) zum Nachweis von Salmonella spp. empfohlen wird. Für die eigenen Untersuchungen war es von Nachteil, dass nur das Wachstum grampositiver Bakterien, nicht aber das der gramnegativen Enterobacteriaceae (BAST 2001) gehemmt wird. Obwohl coliforme Keime Lactose und Saccharose verstoffwechseln und durch den aus der pH-Wert-Änderung resultierenden Farbumschlag des Agars nach „gelb“ von den „rot“

wachsenden Salmonellen zu unterscheiden sind (SELBITZ et al. 1995), konnte dennoch ein massives Wachstum der Caecalflora das Erkennen von Salmonellen erschweren. Deshalb wurde der Agar mit 100 mg/l Nalidixinsäure supplementiert.

Dadurch wurden coliforme Keime weitgehend unterdrückt, die verwendeten

Salmonellen-Stämme konnten aber aufgrund der vorher erfolgten Resistenz-Markierung gegenüber diesem Antibiotikum auf dem supplementierten Nährboden ungehindert wachsen.

Um auch geringe Keimmengen in den untersuchten Organen qualitativ nachweisen zu können, erfolgte Selektiv-Anreicherung (Europäisches Arzneibuch 2002) in einer Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon (TBG-Bouillon). Im Anschluss daran erfolgte ein Ausstreichen auf supplementiertem BPLS-Nährboden. Die Proben der Negativkontrollen wurden dabei auf unsupplementierten BPLS-Nährböden aus-gestrichen, um eine Infektion mit Salmonellen anderer Herkunft ausschließen zu können.

Ergänzend zur Herstellerangabe wurden die nach 24-stündiger Bebrütung noch qualitativ negativen Proben nach einer insgesamt 48-stündigen Bebrütung nochmals auf BPLS-Nähragar ausgestrichen. Dadurch konnte die Anzahl an positiven Proben erhöht werden. Insbesondere die Nachweisrate der Leber ließ sich so um 16,4 % steigern. Ein alleiniger Nachweis nach 48-stündiger Bebrütung ist nicht zu empfehlen, da es vor allem bei Caecumproben zu einem „Umkippen“ des Mediums kommen kann, was den Nachweis der Salmonellen erschwert.

5.2.2 Auswahl zu untersuchender Organe für das Infektionsmodell

Aus den in den Vorversuchen untersuchten Organen konnten in abnehmender Reihenfolge der Höhe der Isolierungsrate aus Caecum, Leber, Milz, Lunge, Gallen-blase, Herz und Gehirn Salmonellen isoliert werden. Das Caecum war, in Abhängig-keit vom Zeitpunkt der Untersuchung, mit einer Isolierungsrate von 100 % am häufigsten mit Salmonellen besiedelt. Dieses deckt sich mit Untersuchungen anderer Autoren (BARROW et al. 1987b; METHNER et al. 1995). Ähnlich wie beim Huhn konnten auch bei der Ente Salmonellen mit Isolierungsraten bis zu 92 %, 62 % und 52 % aus Leber, Milz und Lunge mit nachgewiesen werden. Eine

Salmonellen-Isolierungsrate von maximal 22 % aus Gallenblase oder 8 % aus dem Gehirn deutet ebenfalls an, dass bezüglich der Organbesiedlung keine grundsätzlichen Unter-schiede zwischen der Salmonellen-Infektion des Huhnes und der Ente bestehen. Da nur hohe Isolierungsraten eine gute Diskriminierung zwischen unterschiedlich infi-zierten Gruppen erwarten lassen, lag es nahe, für weiterführende Untersuchungen den Salmonellen-Nachweis aus Caecum, Leber und Milz zu führen.

Nach Infektion von 5 oder 8 Tage alten Entenküken konnten 3 Tage p.i. Salmonellen zwischen 10⁴ und 10⁵ KbE/g Caecuminhalt nachgewiesen werden (siehe 4.3.2.1).

Wurden dagegen in Untersuchungen von BARROW et al. (1999) Entenküken am ersten Lebenstag mit einer höheren Dosis von 10^8,7 KbE inokuliert, ließen sich 3 Tage p.i. durchschnittlich 10^6,8 KbE/g nachweisen, was vielleicht unabhängig von der höheren Infektionsdosis auf eine noch gesteigerte Empfänglichkeit in diesem Alter hindeutet. Eine etwas höhere Empfänglichkeit von Hühnern für Salmonellen-Infektion kann aus Untersuchungen von METHNER et al. (1995) abgeleitet werden, weil sich nach Infektion 8 Tage alter Küken mit 10⁹ KbE nach 7 Tagen noch 10^5,5 KbE/g Cecuminhalt reisoliert wurden. Besonders in den ersten Tagen nach der Infektion waren in allen Altersgruppen nach Infektion mit S. Typhimurium im Mittel höhere Keimgehalte zu ermitteln als nach Infektion mit S. Enteritidis. Diese Beob-achtung wird durch die Untersuchungsergebnisse von BARROW et al. (1999) gestützt.

Aus der Leber (siehe 4.3.2.2) konnten am zweithäufigsten Salmonellen isoliert werden; dabei zeichnet sich ein deutlicher Unterschied zwischen einer Infektion mit S. Enteritidis und S. Typhimurium ab. So konnte in Abhängigkeit vom Alter der Enten und dem Zeitpunkt der Untersuchung S. Typhimurium maximal in 90 %, S. Enteritidis dagegen nur in maximal 70 % der Lebern nachgewiesen werden. Dieser Unterschied zwischen beiden Salmonellen-Serovaren lässt sich auch in den quantitativen Untersuchungsergebnissen wieder finden: während der drei ersten Untersuchungs-termine nach der Infektion lagen die Keimzahlen für S. Typhimurium zwischen 10¹ und 10² KbE/g Leber, während sie für S. Enteritidis im selben Zeitraum stets unter

10¹ KbE/g lagen. Bezogen auf eine Infektion mit S. Enteritidis bei Hühnern stehen die Ergebnisse von DUCHET-SUCHAUX et al. (1997) insofern mit den eigenen Unter-suchungen in Einklang als auch dort in der Leber nie Reisolierungsraten über 10² KbE/g gefunden wurden. Dagegen wiesen METHNER et al. (1995) bei Hühnern mit Keimzahlen zwischen 10³ bis10⁴ KbE/g Leber deutlich mehr Salmonellen nach;

gleichzeitig berichten sie allerdings, dass kein Unterschied zwischen S. Enteritidis und S. Typhimurium erkannt wurde.

Ähnlich wie bei der Leber ergab sich auch für den Salmonellen-Nachweis aus der Milz, dass ein Zusammenhang (siehe 4.3.1.3 und 4.3.3) zwischen dem Alter der Entenküken und dem Untersuchungszeitpunkt besteht. Höhere Isolierungsraten wurden stets bei jüngeren Tieren am 5. bis 7. Tag p.i. erzielt. Allerdings lagen die Isolierungsraten aus der Milz stets niedriger als die aus der Leber. Bei Unter-suchungen am Huhn wurden dagegen stets höhere Keimzahlen und/oder Iso-lierungsraten aus der Milz berichtet, und zwar sowohl nach Infektion von Küken (BARROW et al. 1987b; METHNER et al. 1995; DUCHET-SUCHAUX et al. 1997) als auch älteren Legehennen (BARROW u. LOVELL 1991). Während METHNER et al.

(1995) nach Infektion von Hühnerküken keinen Unterschied zwischen einer S. Enteritidis- und S. Typhimurium-Infektion feststellten, führte in den eigenen Unter-suchungen S. Typhimurium mit maximal 70 % zu einer signifikant höheren Nach-weisrate als S. Enteritidis mit maximal 50 %.

Der häufige Nachweis von Salmonellen in Leber und Milz könnte eine Erklärung darin finden, dass Salmonellen als intrazelluläre Parasiten (POPIEL u. TURNBULL 1985; HORMAECHE et al. 1993) in den reichlich in diesen Organen vorhandenem monozytärem Gewebe vorkommen und besonders häufig in Makrophagen zu finden sind.

Die relativ hohe Nachweisrate von S. Enteritidis mit ca. 20 % und S. Typhimurium mit ca. 30 % in der Lunge (siehe Abb. 8 und 12) in den Vorversuchen werden durch vergleichbare Beobachtungen bei Hühnern von BARROW et al. (1987b) bestätigt

und ebenfalls auf den intrazellulären Verbleib der Salmonellen zurückgeführt. Für diese Erklärung spricht, dass Makrophagen im Bindegewebe des Darmes, in der Leber und Milz und in der Lunge besonders zahlreich vorkommen (JANEWAY et al.

2002). Im Blut sind Salmonellen in geringerem Maße anzutreffen. Dies lässt sich daraus schließen, dass die Isolierungsrate aus dem Herzen (siehe 4.2.2) nur bei 8 % lag und wird auch durch Untersuchungsergebnisse bei Hühnern bestätigt (BARROW et al. 1987b).