3.3 Photoaffinitätsmarkierungen von P-Glykoprotein
3.3.1 Photoaffinity Labeling mit 8-Azido-ATP
3.3.1 Photoaffinity Labeling mit 8-Azido-ATP
Das Adenosintriphosphat (ATP)-Analogon 8-Azido-ATP beinhaltet als photoaktivierbares Strukturelement eine Azid-Gruppe in Position 8 des Adenin-Grundgerüstes. Das Molekulargewicht der freien Säure beträgt etwa 548 g/mol und das UV-Absorptionsmaximum λmax liegt in einer wässrigen Lösung von pH 6 bei 281 nm. Die Struktur von 8-Azido-ATP ist in der nachfolgenden Abbildung dargestellt.
Abb. 3.3: Struktur von 8-Azido-ATP
Die Photoaffinitätsmarkierung von P-gp mit 8-Azido-ATP wurde in Anlehnung an ein von Dr. Jens Meyer etabliertes Protokoll [125] durchgeführt und an einigen Stellen modifiziert. Das 8-Azido-ATP wurde in Form einer 10 mM wässrigen Stammlösung von der Firma Biolog bezogen, aliquotiert und bis zur Verwendung bei – 80 °C gelagert. Der für das Photolabeling-Experiment verwendete Puffer wurde entsprechend einer Vorschrift von Sauna et al. [124] hergestellt und ist in Tabelle 3.18 beschrieben.
In zwei Quarzröhrchen von 100 µl Volumen wurden mit einer 100 µl Hamiltonspritze 22 µl (Probe) bzw. 25 µl (Kontrolle) Photolabeling-Puffer vorgelegt. Anschließend wurden mit einer 10 µl Hamiltonspritze jeweils 5 µl P-gp-Proteoliposomen zugegeben und mit Hilfe eines Mikrorührfisches vermischt. Nachfolgend wurde in eines der beiden Quarzröhrchen (Probe) noch 3 µl 10 mM 8-Azido-ATP-Stammlösung pipettiert und gemischt, so dass für Probe und Kontrolle ein Endvolumen von 30 µl resultierte. Die finale Konzentration von 8-Azido-ATP betrug somit 1 mM, was genau dem Km-Wert entspricht. Probe und Kontrolle wurden daraufhin für 10 min in der Dunkelheit unter Eiskühlung und Rühren auf dem Magnetrührer inkubiert. Im Anschluss daran wurden die weiterhin eisgekühlte Probe und
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Kontrolle in einem UV-Crosslinker bei zwei verschiedenen Wellenlängen λ = 302 nm und λ
= 365 nm für eine definierte Zeitspanne (3; 6; 9; 12 min) bestrahlt. Die kürzerwellige Lichtquelle wurde gewählt, weil in einem zuvor aufgenommenen UV-Spektrum von 8-Azido-ATP die Absorption bei 365 nm nur marginal vorhanden war, bei 302 nm dagegen eine deutliche Absorption stattfand. Nach Beendigung der Bestrahlung wurden Probe und Kontrolle mit einer 10 µl Hamiltonspritze jeweils in ein 0,5 ml LoBind® Eppendorf-Gefäß überführt, mit 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer pH 8 und Trypsin-Lösung (c = 0,1 µg/µl) entsprechend einem Enzym : Protein Verhältnis von 1 : 20 versetzt und für 2,5 h bei 37 °C inkubiert. Der Verdau wurde darauffolgend durch 10 minütiges Erhitzen bei 95 °C inaktiviert, die entstandenen Peptide in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet und bis zur massenspektrometrischen Analyse bei – 20 °C gelagert.
Tab. 3.18: Photolabeling-Puffer nach Sauna et al. [124].
Natriumazid-Stammlösung 100 mM
6,5 mgad 1,0 ml
Natriumazid Wasser
100 mmol/l
Dithiothreitol-Stammlösung 1 M
154,3 mg ad 1,0 ml
Dithiothreitol (DTT) Wasser
1 mol/l
Photolabeling-Puffer (ATPase Assay Buffer) pH 6,8
108,6 mg 37,3 mg 7,6 mg 20,3 mg 7,3 mg 500 µl 20 µl 9,48 ml
2-Morpholinoethansulfonsäure Natriumsalz Kaliumchlorid
EGTA
Magnesiumchlorid-Hexahydrat Ouabain
Natriumazid-Stammlösung 100 mM * DTT-Stammlösung 1 M *
Wasser
50 mmol/l 50 mmol/l 2 mmol/l 10 mmol/l 1 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l Die Feststoffe wurden in einen 15 ml Falcon eingewogen und unter Vortexen in ca. 7 ml destilliertem Wasser gelöst. Anschließend wurde der pH-Wert mittels pH-Meter überprüft und gegebenenfalls mit Salzsäure bzw. Natronlauge auf 6,8 eingestellt. Abschließend wurde das restliche Wasser hinzugegeben und die Pufferlösung bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Die mit einem * gekennzeichneten Bestandteile wurden erst kurz vor Gebrauch zugefügt.
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Bei 8-Azido-ATP als Photoligand ist im Hinblick auf die Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse und die Massenspektrometrie selbst die Besonderheit zu beachten, dass es sich bei der Verbindung um ein Triphosphat mit hoher negativer Eigenladung handelt. Diese Eigenschaft bringt es mit sich, dass man das Molekül im üblicherweise für die Massenspektrometrie genutzten „positive mode“ der Ionisierung nur schlecht detektieren kann und somit in den weniger gebräuchlichen „negative mode“ der Ionisierung wechseln sollte. Der „negative mode“ birgt den Nachteil, dass die Signalintensität im Vergleich zum „positive mode“ deutlich niedriger ist. Eine Möglichkeit, der herabgesetzten Signalintensität entgegenzuwirken, stellt die Technik der Phosphopeptid-Anreicherung mit Titandioxid dar. In der Literatur wird diese Technik auch als Metal Oxide Affinity Chromatography (MOAC) bezeichnet [126]. Hierbei werden Peptide, die Phosphatgruppen tragen (z. B. durch posttranslationale Modifikation) an mit Titandioxid beschichtete magnetische Kügelchen gebunden und dadurch angereichert.
Treibende Kraft der Anreicherung ist die starke Wechselwirkung der positiv geladenen Titankationen mit den Phosphatgruppen. Die meisten anderen Peptide werden durch mehrmaliges Waschen entfernt, allerdings binden unmodifizierte Peptide, die einen hohen Anteil an den sauren Aminosäuren Aspartat und Glutamat besitzen, ebenfalls an die Titandioxid Beads. Da mit 8-Azido-ATP markierte Peptide ebenfalls negativ geladen sind, sollten sich diese durch die MOAC-Technik gleichfalls anreichern lassen.
Die Anreicherung wurde entsprechend einem Protokoll aus der Arbeitsgruppe von Dr.
Sabine Metzger am BMFZ der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf durchgeführt und ist im Folgenden beschrieben. Die verwendeten Lösungen sind Tabelle 3.19 zu entnehmen.
Als Erstes wurden fünf 0,5 ml LoBind® Eppendorf-Gefäße für die unterschiedlichen Fraktionen der MOAC beschriftet: 1) FT TiO2 2) W TiO2 3) Elu TiO2 4) FT R3 5) Elu R3.
Anschließend wurden die Peptide in 100 µl Auftragspuffer aufgenommen und für 10 min auf dem Schüttler inkubiert. Nachfolgend wurde diese Peptid-Lösung mit 0,3 mg Titandioxid Beads vermischt, für 10 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert und mit der Tischzentrifuge zum Pelletieren der Titandioxid Beads 1 min zentrifugiert.
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Tab. 3.19: Lösungen für die TiO2-Anreicherung.
Auftragspuffer: 80 % ACN / 5 % TFA / 1 M Glykolsäure
800 µl50 µl 76,1 mg 150 µl
Acetonitril 100 %
Trifluoressigsäure 100 % Glykolsäure
Wasser
80 % (V/V) 5 % (V/V) 1 mol/l
Waschpuffer 1: 80 % ACN / 1 % TFA
800 µl 10 µl 190 µl
Acetonitril 100 %
Trifluoressigsäure 100 % Wasser
80 % (V/V) 1 % (V/V)
Waschpuffer 2: 20 % ACN / 0,5 % TFA
200 µl 5 µl 795 µl
Acetonitril 100 %
Trifluoressigsäure 100 % Wasser
20 % (V/V) 0,5 % (V/V)
Elutionspuffer: 1 % Ammoniak-Lösung pH 11,3
40 µl 960 µl
Konz. Ammoniak-Lösung 25 % Wasser
1 % (V/V)
Elutionspuffer ESI-MS: 60 % MeOH / 5 % TFA
600 µl 50 µl 350 µl
Methanol 100 %
Trifluoressigsäure 100 % Wasser
60 % (V/V) 5 % (V/V)
Trifluoressigsäure 100 %
Ameisensäure 100 % Ameisensäure 0,1 %
1 µl 999 µl
Ameisensäure 100 % Wasser
0,1 % (V/V)
Titandioxid Beads
DHB (2,5-Dihydroxybenzoesäure) Matrix in 70 % Acetonitril / 1 % Phosphorsäure
Daraufhin wurde der Überstand abgenommen und als Fraktion der „nicht gebundenen Peptide“ in das erste LoBind® Eppendorf-Gefäß FT TiO2 überführt. Die Titandioxid Beads wurden im Anschluss daran mit 50 µl Auftragspuffer gewaschen, durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand abgenommen und im LoBind® Eppendorf-Gefäß FT TiO2
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gesammelt. Danach wurden die Titandioxid Beads mit 50 µl Waschpuffer 1 gewaschen, zentrifugiert und der Überstand als Waschfraktion in das zweite LoBind® Eppendorf-Gefäß W TiO2 überführt. Daran schloss sich ein zweiter Waschschritt mit 50 µl Waschpuffer 2 an und der Überstand wurde nach Zentrifugation und Pelletieren der Titandioxid Beads ebenfalls im LoBind® Eppendorf-Gefäß W TiO2 gesammelt. Die Titandioxid Beads wurden in der Folge für 1 – 2 min in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet. Daran anschließend wurden die Phosphopeptide mit 45 µl Elutionspuffer für 10 min bei RT unter Schütteln von den Titandioxid Beads eluiert.
Während der Elutionszeit der Phosphopeptide wurde der R3-Tip vorbereitet. Hierfür wurden 1 – 3 cm Matrix auf einen Geloader Tip geladen und mit 50 µl 0,1 % Ameisensäure äquilibriert. Nach Ablauf der 10 minütigen Elutionszeit wurde der Elutionsansatz für 1 min zentrifugiert, der Überstand ohne Mitnahme von Titandioxid Beads abgenommen und in das dritte LoBind® Eppendorf-Gefäß Elu TiO2 überführt. Nachfolgend wurden die Titandioxid Beads nochmals mit 20 µl frischem Elutionspuffer für 10 min bei RT unter Schütteln inkubiert und der Überstand nach Zentrifugation und Pelletieren der Beads ebenfalls in das LoBind® Eppendorf-Gefäß Elu TiO2 pipettiert. Die vereinigten Überstände Elu TiO2 wurden daraufhin mit einem Volumen an Trifluoressigsäure 100 % angesäuert, so dass eine finale Konzentration von 10 % Trifluoressigsäure resultierte.
Diese Lösung wurde anschließend sukzessive auf den R3-Tip geladen und der Durchfluss als „ungebundene Fraktion“ im vierten LoBind® Eppendorf-Gefäß FT R3 gesammelt. Der R3-Tip wurde in der Folge mit 50 µl 0,1 % Ameisensäure gewaschen und die Waschfraktion ebenfalls in das LoBind® Eppendorf-Gefäß FT R3 überführt. Die Phosphopeptide wurden im Anschluss daran mit 45 µl Elutionspuffer ESI-MS vom R3-Tip in das fünfte LoBind® Eppendorf-Gefäß Elu R3 eluiert. Zusätzlich wurde eine zweite Elution für die Analyse mittels MALDI-TOF durchgeführt und das Eluat mit 1,5 – 2 µl 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) / 1 % Phosphorsäure direkt auf dem Target gemischt. Die gesammelten Fraktionen wurden abschließend in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet und bei – 20 °C eingefroren.