Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

4.2.2.3 Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

zeitraubender MS/MS-Spektren kann somit entfallen. Von Nachteil ist allerdings, dass die 32 Methionine nicht gleichmäßig über die gesamte P-gp-Sequenz verteilt sind, sondern teils gehäuft vorkommen und teils weit auseinander liegen. Somit entstehen einerseits sehr kleine und andererseits äußerst große Peptide. Die sehr kleinen Peptide sind aufgrund ihres niedrigen Informationsgehalts nur von geringem Interesse und im Falle der sehr großen Peptide mit äußerst hohen Massen ist die Signalintensität oftmals dermaßen gering, dass nur schwer zwischen Signal und Rauschen unterschieden werden kann und eine Detektion somit ausbleibt.

In den nachfolgenden beiden Tabellen 4.7 und 4.8 sind die im Rahmen des In-Lösung-Verdaus von P-gp mit Bromcyan erzielten Ergebnisse zusammengefasst. Tabelle 4.7 zeigt die resultierenden Peptide in der Homoserinlakton-Form, während in Tabelle 4.8 die gebildeten Peptide in der Homoserin-Form dargestellt sind.

Tab. 4.7: Peptide aus dem BrCN-In-Lösung-Verdau von P-gp (Homoserinlakton-Form).

Gezeigt sind die aus dem Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp resultierenden Peptide mit der Aminosäure Methionin modifiziert zum Homoserinlakton. Aminosäuren innerhalb der transmembranären Helices sind in pink eingefärbt.

[M+H]

Sequenz Position Topologie

1161,55 QRLYDPTEGM 441-450 NBD 1

1408,82 KEKGIYFKLVTM 617-628 NBD 1/Linker

1475,70 TDIFANAGNLEDLM 76-89 ECL 1

1584,95 VVGTLAAIIHGAGLPLM (TM1) 52-68 TM1

1587,80 FRYSNWLDKLYM 40-51 N-Terminus

1783,82 SNITNRSDINDTGFFM 90-105 ECL 1

1861,98 IIEKTPLIDSYSTEGLM 1011-1027 Linker/NBD 2

1937,95 DEIEKAVKEANAYDFIM 498-514 NBD 1

2150,23 LVFGEMTDIFANAGNLEDLM (TM1) 70-89 TM1/ECL 1

2427,30 AVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIM (TM12) 987-1010 TM12/Linker

2515,15 SNITNRSDINDTGFFMNLEEDM 90-111 ECL 1

2531,26 SNITNRSDINDTGFFMoxNLEEDM 90-111 + Ox. ECL 1

2645,21 QTAGNEVELENAADESKSEIDALEM 629-653 Linker

3326,74 YAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAM (TM11) 920-948 ICL 4/TM11 4009,01 RQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGM

(TM3)

157-192 ICL 1/TM3

4.2.2.3 Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

Von den 33 theoretisch möglichen Bromcyan-Peptiden konnten lediglich 15 experimentell durch den Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp erzeugt werden. Hierunter befinden sich erfreulicherweise vier Peptide mit Aminosäuren im Bereich der transmembranären Helices 1, 3, 11 und 12.

Tab. 4.8: Peptide aus dem BrCN-In-Lösung-Verdau von P-gp (Homoserin-Form).

Aufgeführt sind die im Zuge des Bromcyan-In-Lösung-Verdaus von P-gp entstandenen Peptide mit der Aminosäure Methionin modifiziert zum Homoserin. Aminosäuren innerhalb der transmembranären Helices sind in pink dargestellt.

[M+H]

Sequenz Position Topologie

1426,83 KEKGIYFKLVTM 617-628 NBD 1/Linker

1493,71 TDIFANAGNLEDLM 76-89 ECL 1

1602,96 VVGTLAAIIHGAGLPLM (TM1) 52-68 TM1

1605,81 FRYSNWLDKLYM 40-51 N-Terminus

1801,84 SNITNRSDINDTGFFM 90-105 ECL 1

1879,99 IIEKTPLIDSYSTEGLM 1011-1027 Linker/NBD 2

1955,96 DEIEKAVKEANAYDFIM 498-514 NBD 1

2445,31 AVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIM (TM12) 987-1010 TM12/Linker

2663,22 QTAGNEVELENAADESKSEIDALEM 629-653 Linker

3344,75 YAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAM (TM11) 920-948 ICL 4/TM11 4027,02 RQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGM (TM3) 157-192 ICL 1/TM3

Des weiteren wurden zwei Peptide, die eine verpasste Schnittstelle („missed cleavage“) enthalten und ein Peptid, bei dem das Methionin oxidiert vorliegt, gefunden. Diese 15 Peptide machen 241 von 1280 Aminosäuren = 19 % der gesamten P-gp-Aminosäuresequenz aus. Die mittels Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp erzielte Sequenzabdeckung liegt damit weit unterhalb der Sequenzabdeckungen, welche durch den Trypsin- bzw. Chymotrypsin-In-Lösung-Verdau von P-gp erreicht werden konnten.

Allerdings ist der Anteil transmembranärer Bereiche an der gesamten Sequenzabdeckung bei Bromcyan im Vergleich zu Trypsin und Chymotrypsin deutlich höher. Der Grund für diese extrem niedrige Sequenzabdeckung ist wahrscheinlich die bereits erwähnte ungleichmäßige Verteilung der Methionine über die P-gp-Sequenz und dadurch bedingt die Bildung sowohl sehr kleiner als auch sehr großer Peptide. Diese sind entweder wegen ihres niedrigen Informationsgehaltes nicht von Interesse oder besitzen aufgrund ihrer

4.2.2.3 Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

extrem hohen Masse eine so geringe Signalintensität, dass sie im Grundrauschen untergehen und damit nur schwer detektiert werden können.

In der folgenden Abbildung 4.11 ist die durch den Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp erzielte Sequenzabdeckung graphisch veranschaulicht. Sequenzabschnitte, die durch den In-Lösung-Verdau von P-gp mit Bromcyan eindeutig identifiziert und zugeordnet werden konnten, sind in rot eingefärbt. Es wird deutlich, dass die Sequenzabdeckung im Bereich der transmembranären Domänen im Vergleich zu derjenigen in den Linker-, Loop- und NBD-Regionen bei insgesamt sehr niedriger Sequenzabdeckung relativ hoch ist. So konnte die TM1 fast vollständig, TM11 und TM12 etwa zur Hälfte sowie der Anfang von TM3 durch den Bromcyan-In-Lösung-Verdau abgedeckt werden.

1 MDLEGDRNGG AKKKNFFKLN NKSEKDKKEK KPTVSVFSMF RYSNWLDKLY

51 MVVGTLAAII HGAGLPLMML VFGEMTDIFA NAGNLEDLMS NITNRSDIND TM 1 101 TGFFMNLEED MTRYAYYYSG IGAGVLVAAY IQVSFWCLAA GRQIHKIRKQ TM 2 151 FFHAIMRQEI GWFDVHDVGE LNTRLTDDVS KINEGIGDKI GMFFQSMATF TM 3 201 FTGFIVGFTR GWKLTLVILA ISPVLGLSAA VWAKILSSFT DKELLAYAKA TM 3 + 4 251 GAVAEEVLAA IRTVIAFGGQ KKELERYNKN LEEAKRIGIK KAITANISIG TM 5 301 AAFLLIYASY ALAFWYGTTL VLSGEYSIGQ VLTVFFSVLI GAFSVGQASP TM 5 + 6 351 SIEAFANARG AAYEIFKIID NKPSIDSYSK SGHKPDNIKG NLEFRNVHFS

401 YPSRKEVKIL KGLNLKVQSG QTVALVGNSG CGKSTTVQLM QRLYDPTEGM 451 VSVDGQDIRT INVRFLREII GVVSQEPVLF ATTIAENIRY GRENVTMDEI 501 EKAVKEANAY DFIMKLPHKF DTLVGERGAQ LSGGQKQRIA IARALVRNPK 551 ILLLDEATSA LDTESEAVVQ VALDKARKGR TTIVIAHRLS TVRNADVIAG 601 FDDGVIVEKG NHDELMKEKG IYFKLVTMQT AGNEVELENA ADESKSEIDA 651 LEMSSNDSRS SLIRKRSTRR SVRGSQAQDR KLSTKEALDE SIPPVSFWRI

701 MKLNLTEWPY FVVGVFCAII NGGLQPAFAI IFSKIIGVFT RIDDPETKRQ TM 7 751 NSNLFSLLFL ALGIISFITF FLQGFTFGKA GEILTKRLRY MVFRSMLRQD TM 8 801 VSWFDDPKNT TGALTTRLAN DAAQVKGAIG SRLAVITQNI ANLGTGIIIS TM 9 851 FIYGWQLTLL LLAIVPIIAI AGVVEMKMLS GQALKDKKEL EGSGKIATEA TM 9 + 10 901 IENFRTVVSL TQEQKFEHMY AQSLQVPYRN SLRKAHIFGI TFSFTQAMMY TM 11 951 FSYAGCFRFG AYLVAHKLMS FEDVLLVFSA VVFGAMAVGQ VSSFAPDYAK TM 11 + 12 1001 AKISAAHIIM IIEKTPLIDS YSTEGLMPNT LEGNVTFGEV VFNYPTRPDI

1051 PVLQGLSLEV KKGQTLALVG SSGCGKSTVV QLLERFYDPL AGKVLLDGKE 1101 IKRLNVQWLR AHLGIVSQEP ILFDCSIAEN IAYGDNSRVV SQEEIVRAAK 1151 EANIHAFIES LPNKYSTKVG DKGTQLSGGQ KQRIAIARAL VRQPHILLLD 1201 EATSALDTES EKVVQEALDK AREGRTCIVI AHRLSTIQNA DLIVVFQNGR 1251 VKEHGTHQQL LAQKGIYFSM VSVQAGTKRQ

Abb. 4.11: Graphische Darstellung der Sequenzabdeckung von P-gp erzielt durch den In-Lösung-Verdau mit Bromcyan. Mittels BrCN-In-In-Lösung-Verdau von P-gp abgedeckte Sequenzbereiche sind in rot dargestellt. Die erreichte Sequenzabdeckung beträgt 19 %.

4.2.2.3 Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

Abb. 4.12: Bildliche Darstellung der durch den Bromcyan-In-Lösung-Verdau erzielten Sequenzabdeckung von P-gp. In blau eingefärbt sind Sequenzabschnitte, die durch den Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp abgedeckt werden konnten. In weiß dargestellt sind die nicht abgedeckten Bereiche von P-gp. Es ist ersichtlich, dass die insgesamt erzielte Sequenzabdeckung mit 19 % im Vergleich zu den vorhergehenden Verdaus von P-gp mit Trypsin und Chymotrypsin sehr niedrig ist. Nichtsdestotrotz konnten größere Teile der transmembranären Helices 1, 11 und 12 sowie der Anfang der TM3 abgedeckt werden.

4.2.2.3 Bromcyan-In-Lösung-Verdau von P-gp

Verglichen mit der durch Trypsin bzw. Chymotrypsin insgesamt erzielten Sequenzabdeckung von P-gp, schneidet Bromcyan sichtlich schlechter ab. Betrachtet man dagegen ausschließlich die transmembranäre Sequenzabdeckung, ist Bromcyan Trypsin deutlich überlegen und Chymotrypsin zumindest äquivalent. Sehr positiv zu bewerten ist weiterhin, dass im Vergleich zu Chymotrypsin (TM4, TM8 und TM9) andere transmembranäre Helices (TM3 und TM11) abgedeckt werden konnten, so dass sich die beiden Spaltungs-Reagenzien in der Hinsicht sinnvoll ergänzen.

Um die Sequenzabdeckung von P-gp in den transmembranären Domänen gezielt noch weiter zu verbessern, sollte als nächstes die Endopeptidase Pepsin für den In-Lösung-Verdau zum Einsatz kommen. Diese unspezifische Protease spaltet mit Vorliebe nach den beiden sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure sowie hinter unpolaren aliphatischen Aminosäuren wie Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin und den aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin.