In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

In einem weiteren Optimierungsversuch zur Erhöhung der transmembranären Sequenzabdeckung von P-gp, kamen mit der Massenspektrometrie kompatible, säurelabile Detergenzien zum Einsatz. Diese Reagenzien fungieren bei neutralem pH-Wert als potente Detergenzien, indem sie eine Solubilisierung des Proteins bewirken und lassen sich durch Zugabe von final 0,5 – 1 % Trifluoressigsäure innerhalb von 15 – 30 min bei 37 °C bzw. RT zu Produkten abbauen, die nicht mit der Massenspektrometrie interferieren. Durch den Zusatz von 0,05 – 2 % dieser Detergenzien zum jeweiligen Verdau-Puffer kann die Zugänglichkeit der hydrophoben transmembranären Bereiche für die eingesetzten Enzyme durch Entfaltung verbessert werden. Die erhöhte Zugänglichkeit geht mit einem effizienteren Verdau der transmembranären Domänen einher, was sich wiederum in einer gesteigerten Sequenzabdeckung dieser Bereiche zeigt.

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

Für den Verdau von P-gp wurden zwei anionische, ein nichtionisches und ein zwitterionisches säurelabiles Detergens eingesetzt und mit den Enzymen Trypsin, Chymotrypsin und Elastase kombiniert. Die verwendeten Detergenzien unterscheiden sich in ihrer kritischen Mizellbildungskonzentration (Critical Micelle Concentration = CMC) und wurden in unterschiedlich hohen Konzentrationen den jeweiligen Verdau-Puffern zugesetzt. Durch Variation der Detergens-Konzentration wurde für einige der verwendeten Enzym-Detergens-Kombinationen die optimale Arbeitskonzentration des eingesetzten Detergens ermittelt. Für andere Enzym-Detergens-Kombinationen wurde dagegen eine fixe Konzentration gewählt und der Einfluss des Detergens-Zusatzes auf die transmembranäre Sequenzabdeckung entsprechend untersucht.

Tab. 3.16: Übersicht der verwendeten Enzym-Detergens-Kombinationen.

Detergens Eigenschaft Enzym Finale Konzentration

AALS II anionisch Trypsin 0,1 %

AALS II anionisch Chymotrypsin 0,1 – 2 %

ZALS I zwitterionisch Trypsin 0,1 %

ZALS I zwitterionisch Chymotrypsin 0,1 %

NALS II nichtionisch Chymotrypsin 0,05 – 1 %

ProteaseMAX® anionisch Trypsin 0,05 %

ProteaseMAX® anionisch Chymotrypsin 0,05 %

ProteaseMAX® anionisch Elastase 0,05 %

a) AALS II in Kombination mit Trypsin und Chymotrypsin

Von den vier zur Verfügung stehenden massenkompatiblen Detergenzien wurde als Erstes das AALS II (Anionic Acid Labile Surfactant) der Firma Protea mit einer CMC von 1,9 mM in einer finalen Konzentration von 0,1 % mit den Enzymen Trypsin und Chymotrypsin kombiniert. Anschließend wurden zur Ermittlung der optimalen Arbeitskonzentration von AALS II für den Verdau mit Chymotrypsin AALS II-Konzentrationen von final 0,5 – 2 %

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

untersucht. Der in der Produktinformation empfohlene Konzentrationsbereich von AALS II liegt zwischen 0,01 und 2 % final [114].

Für den Verdau von P-gp mit Trypsin bzw. Chymotrypsin unter Zusatz von 0,1 - 2 % AALS II wurden zunächst 5 µl P-gp-Proteoliposomen (5,7 µg) in einem entsprechenden Volumen des jeweiligen Verdau-Puffers (25 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung pH 8 bzw.

100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8) suspendiert, so dass sich für das Gesamtvolumen des Verdaus einschließlich der AALS II- und Enzymstammlösung 100 µl ergaben. Anschließend wurden zwei AALS II-Stammlösungen der Konzentration 1 % und 10

% in destilliertem Wasser hergestellt. Die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer ist in Tabelle 3.17 beschrieben. Darauffolgend wurden die AALS II-Stammlösungen mit der P-gp-Suspension derart verdünnt, dass finale Konzentrationen von 0,1 %; 0,5 %; 1 %; 1,5 % und 2 % AALS II erhalten wurden. Der Verdau wurde im Anschluss daran durch Zugabe der Enzymstammlösung in einem Enzym : Protein Verhältnis von 1 : 20 (2,85 µl Trypsin- bzw. Chymotrypsin-Lösung c = 0,1 µg/µl) gestartet und für 2,5 h beim jeweiligen Temperatur-Optimum des verwendeten Enzyms (37 °C bzw. 25 °C) inkubiert. Danach wurde der Verdau durch Hitzeinaktivierung des Enzyms für 10 min bei 95 °C gestoppt und das AALS II durch Zugabe von 11 µl Trifluoressigsäure 10 % (1 % final) innerhalb von 30 min bei RT zu massenkompatiblen Produkten abgebaut.

Abschließend wurden die erhaltenen Peptide in der Vakuum-Zentrifuge zur Trockene eingeengt und bei – 20 °C gelagert.

b) ZALS I in Kombination mit Trypsin und Chymotrypsin

Das zwitterionische Detergens ZALS I (Zwitterionic Acid Labile Surfactant) wurde ebenfalls von der Firma Protea bezogen und für den Verdau von P-gp in einer fixen Konzentration von 0,1 % mit den Enzymen Trypsin und Chymotrypsin kombiniert. Das Detergens hat eine CMC von 3,4 mM und wird üblicherweise in einem Konzentrationsbereich von 0,01 – 0,1 % eingesetzt [115].

Analog zum Verdau mit AALS II wurden als Erstes 5 µl (5,7 µg) aufgereinigtes P-gp in 82,2 µl 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer pH 8 (Trypsin) bzw. 100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8 (Chymotrypsin) gelöst. Im Anschluss daran erfolgte die

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

Herstellung einer 1 %igen Lösung von ZALS I in destilliertem Wasser entsprechend Tabelle 3.17. Von dieser Lösung wurden daraufhin 10 µl zur P-gp-Suspension gegeben, so dass eine finale Konzentration von 0,1 % ZALS I resultierte. Nachfolgend wurden 2,85 µl Trypsin- bzw. Chymotrypsin-Lösung (0,1 µg/µl) entsprechend einem Enzym : Protein Verhältnis von 1 : 20 zugegeben und für 2,5 h bei 37 °C bzw. 25 °C inkubiert. Daran schlossen sich die Inaktivierung des Verdaus durch 10 minütiges Erhitzen bei 95 °C und die Zersetzung des ZALS I innerhalb von 30 min bei RT durch Zugabe von final 1 % Trifluoressigsäure an. Abschließend wurden die entstandenen Peptide getrocknet und bei – 20 °C aufbewahrt.

c) NALS II in Kombination mit Chymotrypsin

Das nichtionische Detergens NALS II (Non-Ionic Acid Labile Surfactant) wurde analog dem AALS II und ZALS I von der Firma Protea bezogen und als mit der Massenspektrometrie kompatible Alternative zu den nichtionischen Detergenzien Triton X-100 bzw. Tween 20 mit Chymotrypsin kombiniert. Das Tensid zeichnet sich durch eine sehr geringe CMC von 0,44 mM aus und wird üblicherweise in einem Konzentrationsbereich von 0,01 – 1 % eingesetzt [116].

Für den Verdau von P-gp mit Chymotrypsin unter Zusatz von NALS II wurden vier verschiedene Detergens-Konzentrationen von 0,05 – 1 % final gewählt, mit dem Ziel, die am besten tolerierte und effizienteste Konzentration zu bestimmen und für die nachfolgenden Verdaus zu übernehmen. Hierfür wurde als Erstes eine 2 %ige Stammlösung von NALS II in einer Mischung aus 20 % Acetonitril in 100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8 laut Tabelle 3.17 hergestellt. Anschließend wurden pro Reaktionsansatz 5 µl aufgereinigtes P-gp (5,7 µg) in einem entsprechenden Volumen an Verdau-Puffer suspendiert, so dass sich für das Gesamtvolumen des Verdaus einschließlich Detergens und Enzymstammlösung 100 µl ergaben. Darauffolgend wurde die 2 %ige NALS II-Stammlösung mit der P-gp-Suspension derart verdünnt, dass finale Konzentrationen von 0,05 %; 0,1 %; 0,5 % und 1 % NALS II erhalten wurden. Durch Zugabe von jeweils 2,85 µl Chymotrypsin-Lösung (c = 0,1 µg/µl) entsprechend einem Enzym : Protein Verhältnis von 1 : 20 wurde der Verdau dann gestartet und bei 25 °C für 30 min bzw. 2,5 h inkubiert. Die Inaktivierung des Verdaus erfolgte im Anschluss durch 10

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

minütiges Erhitzen auf 95 °C und nachfolgend wurde das NALS II durch Zugabe von final 1 % Trifluoressigsäure und 30 minütige Inkubation bei RT abgebaut. Die entstandenen Peptide wurden abschließend in der Vakuum-Zentrifuge zur Trockene eingedampft und bis zur weiteren Analyse bei – 20 °C gelagert.

d) ProteaseMAX® in Kombination mit Trypsin, Chymotrypsin und Elastase

Als vierter und letzter Vertreter der säurelabilen massenkompatiblen Detergenzien wurde das anionische ProteaseMAX® der Firma Promega hinsichtlich seines Einflusses auf die transmembranäre Sequenzabdeckung von P-gp untersucht. ProteaseMAX® ist chemisch gesehen ein hydrophobes anionisches Sulfonat mit einem Molekulargewicht von 425 Dalton und kann durch Zusatz von final 0,5 % Trifluoressigsäure innerhalb von 15 min bei 37 °C bzw. 5 minütiges Erhitzen auf 95 °C bei neutralem pH-Wert gespalten werden.

Als Abbauprodukte entstehen eine hydrophile zwitterionische Verbindung mit einer Molekülmasse von 139 Dalton, eine neutrale hydrophobe Struktur mit einem Molekulargewicht von 238 Dalton und Ameisensäure, die allesamt nicht mit der Massenspektrometrie interferieren [117].

Tab. 3.17: Lösungen für den Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien.

AALS II-Stammlösung 10 %

5 mg

ad 50 µl

AALS II Wasser

10 % (m/V)

AALS II-Stammlösung 1 %

1 mg ad 100 µl

AALS II Wasser

1 % (m/V)

NALS II-Stammlösung 2 %

5 mg ad 250 µl

NALS II

20 % Acetonitril in 100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8

2 % (m/V)

ZALS I-Stammlösung 1 %

1 mg

ad 100 µl

ZALS I Wasser

1 % (m/V)

ProteaseMAX®-Stammlösung 1 %

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien 1 mg

ad 100 µl

ProteaseMAX®

Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung 50 mM pH 8

1 % (m/V)

ProteaseMAX®-Lösung 0,2 %

20 µl 80 µl

ProteaseMAX®-Stammlösung 1 %

Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung 50 mM pH 8

0,2 % (m/V)

Acetonitril 20 % in Tris-HCl 100 mM / Calciumchlorid 10 mM pH 7,8

50 µl 200 µl

Acetonitril 100 %

100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8

20 % (V/V)

Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung 50 mM pH 8,0

98,8 mg ad 25,0 ml

Ammoniumhydrogencarbonat Wasser

25 mmol/l

Tris-HCl 100 mM / Calciumchlorid 10 mM pH 7,8

605,7 mg 73,5 mg ad 50,0 ml

Tris

Calciumchlorid-Dihydrat Wasser

100 mmol/l 10 mmo/l

Tris-HCl 50 mM pH 9,0

302,8 mg

ad 50,0 ml Tris

Wasser 50 mmol/l

Salzsäure 1 mM

0,05 ml 49,95 ml

1 M Salzsäure Wasser

1 mmol/l

Trifluoressigsäure 10 %

1,00 ml 9,00 ml

Trifluoressigsäure 100 % Wasser

10 % (V/V)

Chymotrypsin-Lösung 0,1 µg/µl

25 µg 250 µl

Chymotrypsin 1 mM Salzsäure

0,1 µg/µl

Elastase-Stammlösung 1 µg/µl

1,00 mg ad 1,00 ml

Elastase Wasser

1 µg/µl

Elastase-Lösung 0,1 µg/µl

100 µl 900 µl

Elastase-Stammlösung 1 µg/µl Wasser

0,1 µg/µl

Trypsin-Lösung 0,1 µg/µl

20 µg 200 µl

Trypsin

1 mM Salzsäure

0,1 µg/µl

3.2.2.10 In-Lösung-Verdau mit massenkompatiblen Detergenzien

Für den In-Lösung-Verdau von Membranproteinen mit Trypsin wird laut Produktinformation eine finale Konzentration von 0,05 % ProteaseMAX® empfohlen [117].

Diese ProteaseMAX®-Konzentration wurde für den Verdau von P-gp mit Trypsin, Chymotrypsin und Elastase übernommen.

Der Verdau von P-gp mit den drei Enzymen erfolgte in Anlehnung an das Standard-Protokoll in der Produktinformation von ProteaseMAX® [117]. Zuerst wurde eine 1 %ige Stammlösung von ProteaseMAX® in frisch zubereitetem 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer pH 8 hergestellt und auf Eis gelagert. Aus dieser 1 %igen Stammlösung wurden dann durch Verdünnung im Verhältnis 1 : 5 mit 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer 100 µl einer 0,2 %igen ProteaseMAX®-Lösung hergestellt und ebenfalls auf Eis aufbewahrt. Die verbleibende 1 %ige ProteaseMAX®-Stammlösung wurde nachfolgend aliquotiert und bei – 20 °C eingefroren. Im Anschluss daran wurden pro Reaktionsansatz 5 µl aufgereinigtes P-gp (5,7 µg) in 20 µl 0,2 %iger ProteaseMAX®-Lösung unter Vortexen solubilisiert. Darauffolgend wurden 71,15 µl des jeweiligen Verdau-Puffers hinzugefügt (50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer pH 8 für Trypsin; 100 mM Tris-HCl / 10 mM Calciumchlorid pH 7,8 für Chymotrypsin; 50 mM Tris-HCl pH 9 für Elastase). Vor Zugabe der jeweiligen Enzym-Lösung wurde allen drei Reaktionsansätzen noch 1 µl 1 %ige ProteaseMAX®-Stammlösung hinzugefügt und gut durchmischt. Damit betrug die finale Gesamtkonzentration von ProteaseMAX® bei einem Endvolumen von 100 µl pro Verdau 0,05 %. In der Folge wurden die jeweiligen Enzym-Lösungen wie in Tabelle 3.17 beschrieben hergestellt und entsprechend einem Enzym : Protein Verhältnis von 1 : 20 dem Verdauansatz zugegeben. Der Verdau von P-gp erfolgte anschließend beim jeweiligen Temperatur-Optimum des Enzyms (37 °C oder 25 °C) für 3 h unter Schütteln. Danach wurde der Verdau durch 10 minütiges Erhitzen bei 95 °C gestoppt, gefolgt vom Abbau des ProteaseMAX® durch Zugabe von 0,5 % Trifluoressigsäure und 15 minütige Inkubation bei 37 °C. Abschließend wurden die erhaltenen Peptide in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet und bei – 20 °C gelagert.

Im Dokument Massenspektrometrische Analyse von enzymatisch-chemischen Verdaus zur Detektion von Photoaffinitätsmarkierungen des ABC-Transporters P-Glykoprotein (Seite 73-80)