Phagen-ELISA zur quantitativen Analyse der Sam68-SH3-Interaktionen

Die Stichprobe der SH3-Domänen aus dem Bio-Panning ist zu klein, um anhand der Häufigkeitsverteilung Aussagen über die relativen Affinitäten zu Sam68 machen zu können.

Daher wurden von den SH3-Phagen, die wenigstens 3x identifiziert wurden, Einzelphagen-Überstände für eine ELISA-Analyse hergestellt. Darüber hinaus wurden zur Analyse Phagen-Überstände der drei Nck1-Domänen herangezogen, da im Bio-Panning eine Bindung der Nck1-SH3-Domäne #2 beobachtet wurde, während in der Literatur eine Bindung nur für Domäne #1 beschrieben ist. Ausserdem wurde der Phage Fyn (#228) analysiert, da seine Interaktion in der Literatur gut beschrieben ist, sowie Lck (#225), das zwar als Binder beschrieben ist, aber im Bio-Panning wahrscheinlich aufgrund seiner niedriger Affinität nicht identifiziert wurde. Als Negativkontrolle wurde die SH3-Domäne von RasGAP (#188) gewählt, da in der Literatur gezeigt wurde, dass sie nicht mit Sam68 interagiert [73,75].

Zur Durchführung des Phagen-ELISAs wurde je 1 µg Sam68 pro Well einer 96-Well-Platte gebunden, Verdünnungsreihen der Phagenüberstände zugegeben und schliesslich die gebundenen Phagen nach gründlichem Waschen mit einem HRP-gekoppelten α-M13-Anti-körper quantifiziert (siehe 2.2.4). Die erhaltenen Bindungskurven sind in Abb. 3.3 gezeigt.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

6 7 8 9 10 11 12 13

log(Phagen-Titer/cfu/ml)

OD (450 nm)

Yes Src

OSF IS2#3

Lck Ly n

Hck Fy n

p85α RasGAP

Nck1#1 Nck1 #2

Nck1#3

Abb. 3.3 Phagen-ELISA zur Abschätzung der Stärke der SH3-Sam68-Bindungen

Je 1 µg Sam68 wurde an die Wells einer ELISA-Platte gebunden. Nach Inkubation mit einer Verdünnungsreihe der Phagenüberstände wurde zur Detektion gebundener Phagen ein HRP-gekoppelter α-M13-Antikörper zugegeben und der ELISA mit TMB-Substratlösung entwickelt. Die erhaltenen OD(450 nm)-Werte wurden normiert und gegen den Logarithmus der Phagen-Konzentration aufgetragen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen ELISAs. Die Negativkontrolle (RasGAP) ist rot eingefärbt.

Die Bindungskurven haben bei halblogarithmischer Auftragung den typischen sigmoiden Verlauf einer einfachen Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung, wie es für die Bindung von SH3-Domänen an ein PxxP-Motiv zu erwarten ist. Die drei stärksten Binder waren Yes, Src und Lyn, alles Vertreter der Src-Kinasen. Die Fyn-SH3-Domäne befand sich bei den schwächeren Bindern, während Lck mit deutlichem Abstand den schwächsten Bindungs-partner darstellte, was gut mit den Bio-Panning-Häufigkeiten korreliert. RasGAP (rote Kurve) band erwartungsgemäss nicht. Für Nck (grüne Kurven) bestätigte sich die auf den Bio-Panning-Daten beruhende Vermutung, dass nur die zweite SH3-Domäne an Sam68 bindet.

Aus dem Diagramm würden sich zwar relative Unterschiede der Bindungsaffinitäten quantifizieren lassen, indem man z. B. die Phagen-Konzentrationen ermittelt, bei denen die halbmaximale Bindung erreicht wird, aber für eine absolute Quantifizierung der Bindungs-konstanten müsste man die Konzentration der Domänen kennen. Die Anzahl der SH3-Domänen pro Phagenpartikel ist jedoch unbekannt.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 OD(450nm)

OD(450 nm) / c(Phagen)/nM

Nef + Hck

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

8 9 10 11 12 13

log(Phagen-Titer/cfu/ml)

OD(450nm)

Nef + Hck Sam68 + Yes

Abb. 3.4 Phagen-ELISA-Analyse der Interaktionen von Nef mit Hck sowie Sam68 mit Yes Der Phagen-ELISA wurde analog zu Abb. 3.3 durchgeführt. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus drei unabhänigen ELISAs ± Standardfehler.

a) Halblogarithmische Auftragung der normierten OD(450 nm)-Werte gegen die Phagen-Konzentration. b) SCATCHARD-Plot der Nef-Hck-Werte. Aus der Steigung ergibt sich ein Kd -Wert von 0,60 nM.

Um dennoch absolute Affinitäten abschätzen zu können, wurde ein Vergleich mit der Interaktion zwischen der SH3-Domäne von Hck und dem HIV Nef-Protein angestellt. LEE et al. ermittelten für diese Interaktion mittels SPR-Messungen den Wert der Dissoziations-konstante von Kd = 250 nM, was einer der stärksten bekannten SH3-Interaktionen entspricht [17]. Der Phagen-ELISA wurde daher analog mit dem Hck-Phagen und rekombinant

hergestelltem His-Nef durchgeführt. Abb. 3.4a zeigt die erhaltene Bindungskurve (grün) im Vergleich mit der Sam68-Yes-Bindungskurve (blau). Die Gegenüberstellung zeigt, dass die Sam68-Yes-Interaktion deutlich stärker ist. Durch eine Auftragung der Nef-Hck-Werte nach SCATCHARD (Abb. 3.4b) lässt sich aus der Steigung der K_d-Wert ermitteln (Steigung = -1 / Kd). Die Ausgleichsgerade hatte eine Steigung von -1,69 / nM, woraus sich für die Interaktion des Phagen mit Nef ein K_d-Wert von 0,60 nM ergibt. Mit dem Literaturwert von 250 nM lässt sich ein Korrekturfaktor von ca. 420 SH3-Domänen pro Phagenpartikel errechnen.

Trägt man analog dazu die Werte des Sam68-Phagen-ELISAs unter Einberechnung dieses Korrekturfaktors nach SCATCHARD auf (Abb. 3.5a), so lassen sich aus den Steigungen die zugehörigen Kd-Werte ermitteln (Abb. 3.5b).

0,00

Abb. 3.5 SCATCHARD-Plot der Bindungskurven des Sam68-Phagen-ELISAs

a) Auftragung der transformierten Daten aus Abb. 3.3 unter Einbeziehung des Korrektur-faktors aus Abb. 3.4. b) Errechnete Kd-Werte für die getesteten Sam68-SH3-Interaktionen, aufsteigend sortiert.

Die ermittelten K_d-Werte liegen im niedrigen nanomolaren Bereich, was für SH3-Domänen-Wechselwirkungen ungewöhnlich stark ist. Diese sind normalerweise mit Dissoziations-konstanten, die im niedrigen mikromolaren Bereich liegen, um einen Faktor von 100 - 1000 schwächer. Es sei daher betont, dass die hier errechneten Kd-Werte den Charakter einer Schätzung haben, weil sie auf dem Vergleich mit der Nef-Hck-Interaktion beruhen.

Ausserdem gelten sie nur für das artifizielle System der Interaktion von Sam68 mit den jeweils viele SH3-Domänen-tragenden Phagen (siehe hierzu auch Diskussion in 4.1).

Eine weitere Analysemöglichkeit der ELISA-Daten stellt die Methode nach HILL dar. Die Auftragung (nicht gezeigt) von log(c(Phage)) gegen log(1/OD-1) liefert eine Gerade mit

Steigung -1 / α, wobei α für den sog. HILL-Koeffizienten steht, der ein Mass für die Kooperativität der Bindung ist. Falls keine Kooperativität stattfindet, was für die SH3-Sam68-Interaktion zu erwarten ist, beträgt der HILL-Koeffizient 1. Tatsächlich ergibt sich für Yes, OSF, Lyn und Fyn der Wert 1,0, die Werte für die anderen SH3-Domänen schwanken zwischen 0,9 und 1,1, was mit den Erwartungen gut übereinstimmt.