Einfluss der SH3-Domänen ohne NES auf die HIV-Replikation

Grundsätzlich besteht die Möglichkeit, dass eine isolierte SH3-Domäne, die sehr stark an Sam68 bindet, dessen Funktion im Rahmen der HIV-Replikation beeinträchtigt, z. B. indem die Wechselwirkung von Sam68 mit anderen zellulären oder viralen Proteinen wie Rev blockiert wird. Um diese Hypothese zu testen, wurde ein HIV-Replikations-Assay (siehe 2.4.6) durchgeführt: HEK293T-Zellen wurden mit dem proviralen Plasmid pNL4-3 und pEYFP-Yes- oder pEYFP-Yes-opt cotransfiziert und anschliessend untersucht, ob sich dadurch die Viruspartikelproduktion veränderte. Als Kontrollen wurden auch pEYFP ohne SH3-Domäne sowie pEYFP-RasGAP mitgeführt, das nicht mit Sam68 interagiert. Um eine eventuelle Dosisabhängigkeit der Proteine beurteilen zu können, wurden die Plasmide in verschiedenen molaren Verhältnissen bezogen auf pNL4-3 eingesetzt, nämlich 1 : 0,25, 1 : 1, 1 : 4 und 1 : 16. Zur Quantifizierung der neu entstandenen Viruspartikel wurden jeweils nach 24 und 48 h die Zellkultur-Überstände abgenommen und mittels des p24-ELISAs analysiert. Die Kontrolle der YFP-SH3-Produktion (Abb. 3.22) erfolgte durch

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HEK293T-Zellen wurden mit 0,25 µg psynGagPol und pEYFP (gelb), pEYFP-RasGAP (weiss), pEYFP-Yes (blau) oder pEYFP-Yes-opt (grau) im molaren Verhältnis 1 : 0,25, 1 : 1, 1 : 4 und 1 : 16 wie angegeben cotransfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und die Fluoreszenzintensität mit dem FACS im FITC-Kanal gemessen.

Gezeigt sind die auf die Probe YFP 1 : 1 normierten Werte (Mittelwert von Dreifachansätzen ± Standardfehler).

Fluoreszenzmessung mit dem Durchflusscytometer (siehe 2.4.4). Wie erwartet wurden alle vier Proteine in linear zunehmenden Mengen produziert, wobei eine Vervierfachung der transfizierten Plasmidmengen jeweils nur zu etwa einer Verdopplung der Proteinmengen führte.

Abb. 3.23a zeigt die gemessenen Viruspartikel-Mengen in Abhängigkeit von der Produktion der verschiedenen YFP-SH3-Domänen. Bedingt durch die Komplexität des Assays schwanken die Werte zwar relativ stark, aber es ist eindeutig erkennbar, dass die Viruspartikelproduktion durch die Anwesenheit grösserer Mengen YFP-Yes und YFP-Yes-opt stark beeinträchtigt wird, nicht jedoch durch YFP oder YFP-RasGAP. Dies lässt darauf schliessen, dass die Inhibition tatsächlich Sam68-spezifisch ist. Yes-opt führt zwar zu einer leicht stärkeren Hemmung als Yes, aber auch die Affinität der Yes-SH3-Domäne scheint bereits hoch genug für die effektive Bindung an Sam68 zu sein. In beiden Fällen ist jedoch eine ausreichend grosse Anzahl Yes(-opt)-Moleküle zur Inhibition erforderlich. In Abb. 3.23b wurden die Werte der verschiedenen YFP-SH3-Proben jeweils auf die YFP-Proben normiert, um eventuelle Effekte auszugleichen, die von der Überexpression der Fremdproteine herrühren. Es ergibt sich ein vergleichbares Bild.

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Abb. 3.23 Einfluss der SH3-Domänen auf die HIV-Replikation

HEK293T-Zellen wurden mit 0,5 µg pNL4-3 (grün) und pEYFP (gelb), pEYFP-RasGAP (weiss), pEYFP-Yes (blau) oder pEYFP-Yes-opt (grau) im molaren Verhältnis 1 : 0,25, 1 : 1, 1 : 4 und 1 : 16 wie angegeben cotransfiziert. Nach 24 h und 48 h wurde jeweils der Zellkulturüberstand abgenommen und die Menge an produziertem Virus durch ELISA-Messung der p24-Konzentration quantifiziert (Mittelwert von Dreifachansätzen ± Standard-fehler).

a) Absolut gemessene p24-Konzentrationen; zur besseren Übersicht wurden die 24 h- und 48 h-Werte aufsummiert. b) Die Werte aus a) wurden jeweils auf den zugehörigen YFP-Wert normiert.

Prinzipiell könnte die oben beschriebene Inhibition der HIV-Replikation durch die Yes- und Yes-opt-SH3-Domänen auch Sam68-unabhängig durch einen indirekten Effekt auf die

Vitalität oder den Metabolismus der Zelle verursacht werden. Um zu überprüfen, ob die beobachtete Hemmung tatsächlich spezifisch für die HIV-Replikation ist, wurde ein analoges Experiment durchgeführt, bei dem anstelle des proviralen Plasmids ein Kontroll-Konstrukt eingesetzt wurde. Die Wahl fiel auf psynGagPol, welches das gagpol-Gen in einer codon-optimierten Version unter der Kontrolle eines CMV-Promotors exprimiert, so dass es nicht dem HI-viralen RNA-Metabolismus unterliegt und damit Sam68-unabhängig exprimiert werden sollte. Das produzierte Protein ist identisch mit demjenigen des Provirus, so dass das gesamte Experiment unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden kann und eine optimale Vergleichbarkeit gewährleistet ist.

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Abb. 3.24 Einfluss der SH3-Domänen auf die Produktion von synGagPol

HEK293T-Zellen wurden mit 0,25 µg psynGagPol (grün) und pEYFP (gelb), pEYFP-RasGAP (weiss), pEYFP-Yes (blau) oder pEYFP-Yes-opt (grau) im molaren Verhältnis 1 : 0,25, 1 : 1, 1 : 4 und 1 : 16 wie angegeben cotransfiziert. Nach 24 h und 48 h wurde jeweils der Zellkulturüberstand abgenommen und die Menge an produzierten Partikeln durch ELISA-Messung der p24-Konzentration quantifiziert (Mittelwert von Dreifach-ansätzen ± Standardfehler).

a) Absolut gemessene p24-Konzentrationen; zur besseren Übersicht wurden die 24 h- und 48 h-Werte aufsummiert. b) Die Werte aus a) wurden jeweils auf den zugehörigen YFP-Wert normiert.

Wie man Abb. 3.24a entnehmen kann, führte die Coexpression von syngagpol mit den YFP-Konstrukten unerwarteterweise zu einer ausgeprägten Dosis-abhängigen Inhibition der Partikelproduktion, und zwar unabhängig davon, ob das YFP mit einer SH3-Domäne fusioniert war. Die wahrscheinlichste Erklärung hierfür ist, dass sowohl syngagpol als auch die yfp(-SH3)-Gene unter der Kontrolle des CMV-Promotors stehen, so dass es zu einer Konkurrenz um bestimmte Transkriptionsfaktoren der Zelle kommt, wohingegen das oben eingesetzte provirale Plasmid den HIV-eigenen LTR-Promotor trägt. Dieser Promotor-Effekt lässt sich durch Normierung der gemessenen Werte der YFP-SH3-Ansätze auf die zugehörigen Werte der YFP-Ansätze kompensieren (Abb. 3.24b). Die transformierten Werte

zeigen wie erwartet, dass die SH3-Domänen keinen Einfluss auf die Partikelproduktion von synGagPol haben. Die gemeinsame Betrachtung beider Experimente bestätigt also, dass die Inhibition durch die Yes- und Yes-opt-SH3-Domänen spezifisch für die HIV-Replikation ist und somit höchstwahrscheinlich auf eine Beeinträchtigung von Sam68 zurückzuführen ist.