4.3 Perspektiven der lanthanoidbasierten Quantifizierung
Die MeCAT-Strategie ist ein wertvolles Werkzeug für die Quantifizierung von Biomolekülen.
Durch die Einführung von Metallkomplexen können die Vorteile der elementmassenspektrometrischen Verfahren für die Analyse von Proteinen genutzt werden.
Die MeCAT-Strategie kann auch für eine molekularmassenspektrometrische Quantifizierung verwendet werden[113]. Durch die in dieser Arbeit durchgeführte Optimierung der Markierungsreaktion konnte das Anwendungspotential der Quantifizierungsstrategie erhöht werden. Für die Analyse von komplexen biologischen Proben weist die Methode jedoch einige Nachteile auf. So ist die Methode nur begrenzt mit der Gelelektrophorese kompatibel, da die mit unterschiedlichen Metallen markierten Proteine nicht mehr komigrieren. Darüber hinaus konnte beobachtet werden, dass mit der etablierten MeCAT-Strategie, welche auf der Markierung von Cysteinresten basiert, nur eine eher geringe Zahl an Proteinen quantifiziert wird. Die Ursache hierfür ist die geringe Häufigkeit, mit der Cystein in Proteinen vorkommt, was ursprünglich dazu genutzt wurde, die Komplexität in der ICP-MS-Analyse zu verringern.
Für eine hinreichende molekularmassenspektrometrische Quantifizierung von komplexen biologischen Proben mit MeCAT wird dementsprechend eine andere Markierungsstrategie benötigt.
Hierfür bietet sich insbesondere die Aminfunktionalität an Lysinresten an. Neben der höheren Abundanz hat Lysin den Vorteil einer hohen Basizität, was sich günstig auf die Ionisierbarkeit der markierten Peptide auswirkt. Darüber hinaus wird bei einer Aminmarkierung auch der N-Terminus markiert, was bei einer Markierung auf Peptidebene dazu führt, dass sämtliche Peptide eine Markierung besitzen und damit für die Quantifizierung genutzt werden können.
Für die Markierung von Aminfunktionen werden insbesondere NHS-Ester eingesetzt. Mithilfe eines entsprechenden MeCAT-Reagenzes konnte auch schon erfolgreich eine Quantifizierung von Modellproteinen durchgeführt werden[103]. NHS-Ester haben allerdings den Nachteil, dass
sie im wässrigen Medium hydrolyseempfindlich sind. EL-KHATIB et al. konnten das Problem umgehen, indem die Modellproteine über ihre Cysteinreste an Resin lokalisiert wurden, wodurch die Markierungsreaktion im wasserarmen Medium durchgeführt werden konnte[103]. Allerdings ist diese Vorgehensweise für die Analyse von komplexen biologischen Proben impraktikabel, einerseits aufgrund der geringen Abundanz von Cystein und andererseits aufgrund von Löslichkeitsproblemen.
Folglich ist für eine erfolgreiche Verwendung dieser Markierungsstrategie für komplexe Proben, wie B. bacteriovorus, zunächst eine Optimierung der Markierung im wässrigen Medium erforderlich. Da auch die ICPL-Strategie mit NHS-Estern arbeitet, sollte eine Verwendung des auf NHS-Ester basierenden MeCAT-Reagenzes im wässrigen Medium prinzipiell möglich sein. Im Zuge dieser Arbeit wurden hierzu auch schon erste Untersuchungen durchgeführt. So konnten durch eine Optimierung der Probenvorbereitung Mischungen von verschiedenen Modellproteinen erfolgreich quantifiziert werden. In Abbildung 35 sind beispielhaft die Quantifizierungsergebnisse einer Mischung aus differentiell markiertem bovinem Serumalbumin in Form eines Boxplot dargestellt.
Abb. 35: Boxplotdiagramm der Quantifizierung einer Mischung aus mit terbium-, holmiun, thulium- und lutetiummarkiertem bovinem Serumalbumin. Die Proteinquantifizierung erfolgte über die Quantifizierungsverhältnisse der tryptischen Peptide. Die Daten wurden auf das Terbiumsignal normiert und logarithmisch ausgewertet. Die eingezeichneten roten Linien entsprechen jeweils dem theoretischen Verhältnis (1:1:1:1).
Die theoretischen Mischungsverhältnisse werden gut abgebildet. Nach einer entsprechenden Validierung der optimierten Markierung könnte die MeCAT-Strategie künftig auch für die molekularmassenspektrometrische Quantifizierung von komplexen biologischen Proben
genutzt werden. Gleichzeitig hätte die Methode auch den Vorteil, dass immer auch parallel eine Quantifizierung mit elementmassenspektrometrischen Verfahren erfolgen könnte.
Im Zuge dieser Arbeit wurde auch ein MeCAT-Reagenz mit Acrylamidfunktionalität entwickelt. Obschon das ursprüngliche Ziel, mit dem Reagenz die potentielle sterische Hinderung bei der Cysteinmarkierung zu umgehen, nicht erreicht werden konnte, konnte das Reagenz sehr erfolgreich als interner Standard für die LA-ICP-MS von Polyacrylamidgelen eingesetzt werden. Dies führte zu einer signifikanten Verbesserung der Qualität der Ablationsbilder und der Quantifizierungsverhältnisse, beispielsweise über den Ausgleich von Oberflächeninhomogenitäten oder Kontaminationen. Weiterhin konnten variierende Analytsignale während und zwischen den Ablationsmessungen korrigiert werden. Gegenüber den etablierten Verfahren zur Normierung in der LA-ICP-MS von Polyacrylamidgelen wies der neue interne Standard diverse Vorteile auf. Im Vergleich zum Auftragen einer standardenthaltenden Schicht auf das Probenmaterial ist der neue Standard sehr tolerant gegenüber Oberflächeninhomogenitäten. Der Standard ist weiterhin deutlich empfindlicher als das 13C-Signal gegenüber instrumentellen Fluktuationen und ähnelt in seinem Verhalten sehr den Analyten. Aufgrund dieser Vorteile wurde der interne Standard auch auf die komplexen B. bacteriovorus Proben angewendet. Auch hier führte die Anwendung zu einer Verbesserung der Signale und damit der relativen Quantifizierungsverhältnisse.
In der künftigen Forschung sollte untersucht werden, ob sich der interne Standard auch auf zweidimensionale Polyacrylamidgele anwenden lässt. Dadurch könnte sich das Anwendungsgebiet des internen Standards, gerade auch bezüglich der Analyse von komplexen Proteingemischen, deutlich erweitern. Auf diese Weise ließe sich eventuell auch der Nachteil der unterschiedlichen Migration von MeCAT-markierten Proteinen bei der Gelelektrophorese ausgleichen, indem die Proteine mit dem gleichen Metall markiert und auf unterschiedlichen Gelen getrennt werden. Mithilfe des internen Standards sollte dennoch eine relative Quantifizierung der Proben mittels LA-ICP-MS möglich sein. Auch über eine Nutzung des internen Standards für eine absolute Quantifizierung mittels LA-ICP-MS könnte nachgedacht werden. Dazu müssten aus dem LA-ICP-MS-Signal Rückschlüsse auf die Konzentration des Standards im Gel gezogen werden.