Peripartale Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im bovinen Endometrium

4 Ergebnisse

4.1 Peripartale Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im bovinen Endometrium

Ein Kernpunkt der vorliegenden Arbeit lag im Nachweis exprimierter Toll-like-Rezeptor- (TLR-) und β-Defensingene im bovinen Endometrium. Hierbei sollten mögliche Unterschiede zwischen interkarunkulärem Endometrium (IE) und karunkulärem Endometrium (KE) untersucht werden.

Dabei wurde insbesondere der Frage nachgegangen, ob sich die Erregerrezeptor-Expression (TLRs) und die Effektormolekül-Expression (β-Defensine) zu unterschiedlichen Zeitpunkten peripartal unterscheiden.

Für diese Analysen standen das interkarunkuläre und das karunkuläre Endometrium von Tieren dreier peripartaler Gruppen (A, B und C, siehe Tabelle 3) zur Verfügung.

4.1.1 Peripartale Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im interkarun-kulären Endometrium

Unabhängig von der Tiergruppe (A, B, C, Tabelle 3) konnte die Expression aller untersuchten TLR- und β-Defensingene im interkarunkulären Endometrium (IE) nachgewiesen werden (Tabelle 6). Die Gewebeproben wurden unmittelbar nach der Fruchtentwicklung (Kaiserschnitt bei Gruppe A und B, Spontangeburt bei Gruppe C, vergleiche Tabelle 3) aus dem IE entnom-men und mittels quantitativer RT-PCR vermessen.

Die Expression der untersuchten TLR- und β-Defensingene unterlag in jeder Tiergruppe großen interindividuellen Schwankungen. Die Varianzkoeffizienten schwankten zwischen 36 % (TLR9 in Gruppe C) und 199 % (uDef in Gruppe A). Diese großen Schwankungsbreiten der Werte waren zum Großteil auf Probandensubsets oder einzelne Individuen zurückzuführen, die eine über-durchschnittlich hohe Expression einzelner Parameter zeigten (Einzeldaten nicht gezeigt). Auffäl-lig war bspw. ein Tier aus der Gruppe A, welches Kopienzahlen für TLR2- und TLR6-mRNA aufwies, die mehr als 3-mal den Interquartilbereich überschritten (Daten nicht gezeigt). Ein signi-fikanter Unterschied der Expression im IE zwischen den Versuchsgruppen konnte nicht nach-gewiesen werden (Tabelle 6; D).

Tabelle 6: Interkarunkuläre Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im peri-partalen Zeitraum.

I. Gruppe A

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 5527 856 22297 4510 352 14911 214203

CV^b 113 77 62 118 58 94 199

Median 3709 701 14180 3214 302 9000 71377

IQB^c 2153-5211 340-1214 9944-35412 1573-4409 215-547 4736-24696 23477-93236

n^d 9 9 9 9 8 9 7

II. Gruppe B

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 3542 1230 36590 6547 510 8843 71197

CV^b 41 56 48 62 39 97 116

Median 3816 1165 33132 7622 582 5622 42950

IQB^c 1949-4684 697-1165

MW^a 3049 1439 43556 4602 546 8010 27940

CV^b 102 102 87 77 36 98 85

Median 2239 859 46550 3754 582 6555 29801

IQB^c 317-6159 185-2854 3810-78638 1951-7031 350-716 325-16636 1984-47972

n^d 8 8 8 8 8 8 6

IV. Gruppenvergleich

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

p-Wert^e 0,50 0,56 0,39 0,47 0,13 0,44 0,18

a = Mittelwert (mRNA-Kopienzahl pro 75 ng Gesamt-mRNA); b = Variationskoeffizient (CV, Coeffi-cient of Variation); c = Interquartilbereich; d= Anzahl der Werte; e = asymptotische Signifikanz nach Vergleich der Gruppen mittels Kruskal Wallis Test (Signifikanzschwelle: p < 0,0025); Expression bei den drei peripartalen Gruppen A, B und C (Tabelle 3) im IE, Probennahme zum Zeitpunkt der Fruchtent-wicklung. Es lagen keine signifikanten Unterschiede vor.

4.1.2 Peripartale Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im karunkulä-ren Endometrium

Die Expression aller untersuchten Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingene konnte ebenfalls im karunkulären Endometrium (KE) aller drei untersuchten Tiergruppen nachgewiesen werden (Tabelle 7). Gewebeproben wurden unmittelbar nach der Fruchtentwicklung aus dem karunkulä-ren Endometrium entnommen (Tabelle 3) und mittels quantitativer RT-PCR vermessen.

Ebenso wie im interkarunkulären Endometrium unterlag die Expression aller TLRs und Defen-sine einer großen interindividuellen Schwankungsbreite. Die Variationskoeffizienten schwankten von 35% (TLR9, Gruppe B) bis zu 160 % (Gruppe C, uDef) und spiegelten die großen interindi-viduellen Unterschiede in der Expression fast aller gemessenen Parameter innerhalb der Gruppen wider. Dabei fiel TLR9 in allen Gruppen durch eine ausgesprochen geringe Streuung der Expres-sionsstärken auf. Die gemessenen Defensinparameter unterlagen dagegen fast überall den größ-ten Schwankungsbreigröß-ten.

Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen waren nicht festzustellen (Tabelle 7, IV). Im Gegensatz zur Expression im interkarunkulären Endometrium konnten fol-gende Tendenzen beobachtet werden: In der Gruppe C lagen die Mediane der gemessenen mRNA-Kopien für alle TLRs (außer TLR9) etwa doppelt so hoch wie in den Gruppen A und B (Tabelle 7). Das Gleiche galt für BNBD5, nicht aber für universelles Defensin (uDef) (Tabelle 7).

Somit bestanden zwar keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei peripartalen Zeitpunkten (Gruppe A, B und C), allerdings waren tendenzielle Unterschiede ersichtlich, die jedoch durch die große Varianz der Daten nicht zu einem signifikanten Ergebnis führten.

Tabelle 7: Karunkuläre Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im periparta-len Zeitraum

I. Gruppe A

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 1363 655 12496 1616 481 17353 57972

CV^b 46 86 49 61 52 141 88

Median 1257 388 11050 1326 488 7766 44320

IQB^c 882-1881 252-1330 6283-17350 705-2398 317-729 2305-22424 19285-80137

n^d 11 11 11 12 8 11 9

II. Gruppe B

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 1008 673 13603 1456 484 4995 28529

CV^b 51 71 48 47 35 70 66

Median 974 588 11999 1440 488 4784 24540

IQB^c 679-1230 456-743 8128-19663 886-1660 359-655 2404-7139 18927-35159

n^d 11 11 11 11 9 11 10

III. Gruppe C

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 2943 1852 41740 3691 554 21274 134179

CV^b 100 106 115 76 49 123 160

Median 2200 1400 20160 3785 446 14918 37501

IQB^c 547-4426 89-3167 5040-76441 752-6296 330-822 64-30269 17834-249111

n^d 10 10 10 10 10 10 6

IV. Gruppenvergleich

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

p-Wert^e 0,17 0,57 0,39 0,28 0,95 0,23 0,53

a = Mittelwert (mRNA-Kopienzahl pro 75 ng Gesamt-mRNA); b = Variationskoeffizient (CV, Coeffi-cient of Variation); c = Interquartilbereich; d= Anzahl der Werte; e = asymptotische Signifikanz nach Vergleich der Gruppen mittels Kruskal Wallis Test (Signifikanzschwelle: p < 0,0025); Expression bei den drei peripartalen Gruppen A, B und C (Tabelle 3) im KE, Probennahme zum Zeitpunkt der Fruchtent-wicklung. Es liegen keine signifikanten Unterschiede vor.

4.1.3 Unterschiede der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression zwi-schen interkarukulärem und karunkulärem Endometrium

Die tendenziell unterschiedlichen Ergebnisse des Gruppenvergleiches bei den beiden Proben-nahmelokalisationen (4.1.1 und 4.1.2) legten ein unterschiedliches Toll-like-Rezeptor- und

Defen-singen-Expressionsrepertoire zwischen den Geweben innerhalb der Gruppen nahe. Dem wurde im Folgenden vergleichend nachgegangen.

Es wurde untersucht, ob sich die Expression von TLR- und β-Defensingenen im Endometrium innerhalb der Gruppen zwischen den beiden Probenlokalisation unterscheiden.

In der Gruppe A (Abbildung 5) und B (Abbildung 6) wurden im KE tendenziell alle TLRs und Defensine gegenüber dem IE vermindert exprimiert. Diese Unterschiede zwischen den Geweben waren in der Gruppe A bei TLR2 (Abbildung 5) und in der Gruppe B bei TLR2 und TLR4 signi-fikant (Abbildung 6). In der Gruppe C unterschieden sich die Expressionsstärken dagegen zwi-schen IE und KE nicht (Abbildung 7).

Somit zeigte sich, dass sich die beiden beprobten Lokalisationen im bovinen Endometrium in der Rezeptorausstattung zum Teil unterscheiden. Dabei bestand dieser Unterschied nur in den bei-den Gruppen A und B.

Abbildung 5: Vergleichende Darstellung der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären (IE) und karunkulären Endometrium (KE) bei Tieren der Gruppe A.

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die TLR- und β-Defensingen-Expression in Kopienzahl pro 75ng mRNA bei Tieren der Gruppe A (Tabelle 3). Die Expression unterscheidet sich zwischen den Ge-weben bei TLR2 signifikant (° = milde „Ausreißer“, * = extreme „Ausreißer“ (Abbildung 4);

##=p<0,00125, Kruskal Wallis Test).

Abbildung 6: Vergleichende Darstellung der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären (IE) und karunkulären Endometrium (KE) bei Tieren der Gruppe B.

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die TLR- und β-Defensingen-Expression in Kopienzahl pro 75ng mRNA bei Tieren der Gruppe A (Tabelle 3). Die Expression unterscheidet sich zwischen den Ge-weben bei TLR2 und TLR4 signifikant (° = milde „Ausreißer“, * = extreme „Ausreißer“ [Abbildung 4];

##=p<0,00125, ###= p<0,0005, Kruskal Wallis Test).

Abbildung 7: Vergleichende Darstellung der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären (IE) und karunkulären Endometrium (KE) bei Tieren der Gruppe C.

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die TLR- und β-Defensingen-Expression in Kopienzahl pro 75 ng mRNA bei Tieren der Gruppe C (Tabelle 3). Es liegen keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen den Geweben vor (° = milde „Ausreißer“, * = extreme „Ausreißer“ (Abbildung 4), Kruskal Wallis Test).

4.1.4 Korrelationen zwischen der Expression verschiedener Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingene im Peripartum

Im Folgenden wurden Zusammenhänge zwischen den Expressionsstärken verschiedener TLR- und β-Defensingene untersucht. Insbesondere wurde geprüft, welche der erfassten Gene gemein-sam, in Abhängigkeit von der endometrialen Lokalisation sowie abhängig von der Versuchsgrup-pe reguliert wurden. In Tabelle 8 sind die SVersuchsgrup-pearman-Korrelationen zwischen den gemessenen Parametern im interkarunkulären Endometrium dargestellt.

Die meisten signifikant hohen Korrelationen waren in Gruppe C zu beobachten, wobei am häu-figsten Korrelationen von TLR- mit β-Defensingenen auftraten. Dies zeigte sich sowohl im in-terkarunkulären als auch im karunkulären Endometrium (Tabelle 8). Innerhalb der TLRs korre-lierten am häufigsten TLR2 und TLR6 miteinander. Am zweithäufigsten kamen Korrelationen zwischen den beiden Defensinparametern (BNBD5 und uDef) vor. Sonst zeigten sich die Korre-lationen heterogen und ließen keine Muster bezogen auf Gruppen oder Gewebe feststellen. Da-mit erwiesen sich die Genprodukte als interindividuell unterschiedlich reguliert. Dass deutlich die meisten Korrelationen in beiden Geweben in der Gruppe C vorhanden sind, stützt die These, dass Unterschiede in der Expression der TLRs und Defensine je nach peripartalem Stadium vor-liegen.

Tabelle 8: Korrelationen der TLR- und β-Defensingen-Expression im Endometrium pe-ripartal

I. Gruppenübergreifend (interkarunkuläres Endometrium, n=18-28) TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

II. Gruppe A (interkarunkuläres Endometrium, n=5-9)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

III. Gruppe B (interkarunkuläres Endometrium, n=7-11)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

IV. Gruppe C (interkarunkuläres Endometrium, n=6-8)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

Tabelle 8 Fortsetzung

I. Gruppenübergreifend (karunkuläres Endometrium, n=19-32) TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

II. Gruppe A (karunkuläres Endometrium, n=8-12)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

III. Gruppe B (karunkuläres Endometrium, n=7-11)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef IV. Gruppe C (karunkuläres Endometrium, n=6-10)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

Dargestellt sind Korrelationen der TLR- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären und karun-kulären Endometrium unabhängig von Art der Fruchtentwicklung (I = A+B+C) wie auch unter Berück-sichtigung der Gruppen (A, B, C). Korrelationskoeffizienten nach Spearman (*: p < 0,001; r > 0,7). Signi-fikante, hoch-korrelierte Beziehungen sind mit einem Stern (*) ausgezeichnet.

4.2 Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression 24 bis 30 Stunden (h) post partum (p.p.) im bovinen Endometrium

Zu den drei untersuchten peripartalen Zeitpunkten bestanden keine statistisch signifikanten Un-terschiede in der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression unmittelbar nach der Fruchtentwicklung (Tabelle 6, Tabelle 7). Allerdings waren deutliche tendenzielle Unterschiede der Genexpression zwischen den Gruppen feststellbar, die sich auch in unterschiedlichen Korre-lationen zwischen den Genprodukten darstellten (Tabelle 8).

Dies ließ weiterhin vermuten, dass Veränderungen in der TLR- und Defensingen-Expression im Zeitraum unmittelbar um die Geburt je nach Art und Zeitpunkt des Trächtigkeitsendes vorkom-men. Um einem verzögerten Einfluss der Art und des Zeitpunktes des Trächtigkeitsendes auf die TLR- und β-Defensingen-Expression nachzugehen, wurde eine zweite Probennahme 24 bis 30 h nach der Fruchtentwicklung durchgeführt (Tabelle 3). Diese Untersuchungen waren methodisch bedingt nur in den Gruppen B und C möglich (Tabelle 3).

4.2.1 Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären En-dometrium 24 bis 30 h p.p.

Alle untersuchten TLR- und β-Defensingene waren 24 bis 30 h p.p. im interkarunkulären Endo-metrium exprimiert (Tabelle 9). Die Expression der untersuchten Parameter unterlag vergleichbar großen Schwankungen wie unmittelbar nach der Fruchtentwicklung (vergleiche Tabelle 9 und Tabelle 6). Die Varianzkoeffizienten (CV) schwankten zwischen 60% (TLR2 Gruppe B) und 299% (TLR9 Gruppe B). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen lagen nicht vor (Tabelle 9). TLR3 und das Defensingen BNBD5 wurden tendenziell in der Gruppe C (unmit-telbar p.p.) gegenüber Gruppe B (sub partu) verstärkt exprimiert (etwa 3-fache mRNA Kopien-zahl, Tabelle 9).

Tabelle 9: Interkarunkuläre Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression 24 bis 30 h p.p.

I. Gruppe B

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 6082 810 57004 4659 639 8794 949040

CV^b 60 144 108 97 299 85 64

Median 3816 1165 33132 7622 582 5622 42950

IQB^c 1368-6720 348-1338 20501-91270 1000-6705 428-755 1752-11360 120043-198705

n^d 11 11 11 11 8 11 11

II. Gruppe C

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 3732 2743 42627 7686 509 22736 247795

CV^b 142 179 161 124 137 79 163

Median 2815 3726 39700 5551 320 14818 207804 IQB^c 1448-7111 970-3944 19801-55054 1659-14274 251-757 204-32307 110737-404848

n^d 7 7 7 7 7 7 5

III. Gruppenvergleich

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

p-Wert^e 0,821 0,013 0,751 0,258 0,203 0,342 0,777 a = Mittelwert (mRNA Kopienzahl pro 75 ng mRNA); b = Variationskoeffizient (CV, Coefficient of Va-riation); c = Interquartilbereich; d= Anzahl der Werte; e = asymptotische Signifikanz nach Vergleich der Gruppen B und C (Tabelle 3) mittels Kruskal Wallis Test (Signifikanzschwelle: p < 0,0025). Die Gewebe-proben wurden 24 bis 30 h nach Fruchtentwicklung aus dem interkarunkulären Endometrium entnom-men und mittels quantitativer RT-PCR vermessen. Es wurden keine signifikanten Gruppenunterschiede festgestellt.

4.2.2 Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im karunkulären Endo-metrium 24 bis 30 h p.p.

Die Expression aller untersuchten Toll-like-Rezeptoren und β-Defensingene konnte im karunku-lären Endometrium 24 bis 30 h p.p. nachgewiesen werden (Tabelle 10).

Tendenziell wurden 24 bis 30 h p.p. im karunkulären Endometrium alle untersuchten TLR- und β-Defensingene (ausgenommen TLR9) in der Gruppe C verstärkt exprimiert. Aufgrund der gro-ßen interindividuellen Schwankungsbreiten der Expressionsstärken einzelner Parameter (Tabelle 10) waren diese Unterschiede jedoch bei der Anzahl der analysierten Proben nicht signifikant.

Tabelle 10: Karunkuläre Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression 24 bis 30 h p.p.

I. Gruppe B

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 2254 1032 28538 2564 736 16180 145228

CV^b 173 148 203 133 304 114 126

Median 2085 865 28675 2101 633 12420 107721

IQB^c 976-3476 426-1618 18771-41135 1501-3201 542-1010 4519-23908 54960-257004

n^d 10 9 10 9 6 9 9

II. Gruppe C

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

MW^a 4518 2615 67393 5204 400 32485 295439

CV^b 277 107 117 191 286 97 165

Median 5028 1509 47241 4595 352 29906 206309

IQB^c 3188-5592 1347-4436 29135-115727 3173-7539 295-530 70-66188 178568-501441

n^d 5 5 5 5 5 5 3

III. Gruppenvergleich

TLR2 TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

p-Wert^e 0,014 0,072 0,066 0,028 0,028 0,641 0,166 a = Mittelwert (mRNA Kopienzahl pro 75 ng mRNA); b = Variationskoeffizient (CV, Coefficient of Va-riation); c = Interquartilbereich; d= Anzahl der Werte; e = asymptotische Signifikanz nach Vergleich der Gruppen B und C (Tabelle 3) mittels Kruskal Wallis Test (Signifikanzschwelle: p < 0,0025). Die Gewebe-proben wurden 24 bis 30 h nach Fruchtentwicklung aus dem karunkulären Endometrium entnommen und mittels quantitativer RT-PCR vermessen. Es wurden keine signifikanten Gruppenunterschiede festge-stellt.

4.2.3 Unterschiede in der postpartalen Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression zwischen interkarunklärem und karunkulären Endometrium Die tendenziellen Unterschiede des Gruppenvergleiches bei den beiden Probennahmelokalisatio-nen 24 bis 30 h p.p.(siehe 4.2.1 und 4.2.2) wie auch die Unterschiede zwischen den beiden unter-suchten endometrialen Geweben direkt nach der Fruchtentwicklung (siehe 4.1.1 und 4.1.2), leg-ten ein unterschiedliches Toll-like-Rezeptor- und Defensingen-Expressionsrepertoire 24 bis 30 h p.p. zwischen den Geweben nahe. Im Folgenden wurde untersucht, ob sich die Expression von TLR- und β-Defensingenen im Endometrium innerhalb der Gruppen zwischen den beiden Pro-benlokalisation (analog 4.1.3) 24 bis 30 h p.p. unterscheiden. Dazu wurden für jede Tiergruppe die Werte für die Kopienzahl pro 75 ng mRNA einzelner Gene im interkarukulären (IE, Abbildung 8) mit denen im karunkulären Endometrium (KE, Abbildung 9) verglichen. Im Ge-gensatz zu den peripartal entnommenen Proben bestanden 24 bis 30 h p.p. bei keiner Gruppe statistisch signifikante Unterschiede der Expression einzelner Gene zwischen den Gewebetypen IE und KE.

Abbildung 8: Expression der TLR- und β-Defensingene im interkarunkulären (IE) und karunkulären (KE) Endometrium 24 bis 30 h p.p. bei Tieren der Gruppe B

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die TLR- und β-Defensingen-Expression in Kopienzahl pro 75ng mRNA bei Tieren der Gruppe B (Tabelle 3). Die Probennahme erfolgte 24 bis 30 h p.p. Es liegen keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen den Geweben vor (° = milde „Ausreißer“, * = ex-treme „Ausreißer“ [Abbildung 4], Kruskal Wallis Test).

Abbildung 9: Expression der TLR- und β-Defensingene im inkarunkulären (IE) und karunkulären (KE) Endometrium 24 bis 30 h p.p. bei Tieren der Gruppe C

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die TLR- und β-Defensingen-Expression in Kopienzahl pro 75ng mRNA bei Tieren der Gruppe C (Tabelle 3). Die Probennahme erfolgte 24 bis 30 h p.p. Es liegen keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen den Geweben vor (° = milde „Ausreißer“, * = ex-treme „Ausreißer“ (Abbildung 4), Kruskal Wallis Test).

4.2.4 Korrelationen innerhalb der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression 24 bis 30 h post partum

Im Folgenden wurde geprüft, ob die Expressionsstärken einzelner Gene 24 bis 30 h p.p. mitein-ander korreliert waren (Tabelle 11). Gruppenübergreifend (Gruppe B+C) korrelierten TLR2 und TLR6 miteinander hoch signifikant sowohl im interkarunkulären als auch im karunkulären En-dometrium.

Abhängig von der Art der Fruchtentwicklung, war diese hohe Korrelation nur im interkarunkulä-ren Endometrium der Gruppe B zu beobachten (Tabelle 11). Damit erwies sich die Expression einzelner Gene als abhängig von der uterinen Lokalisation und der Art der Fruchtentwicklung Insgesamt korrelierte am häufigsten die Expression von TLR2 und TLR6. Eine gehäufte Anzahl von Korrelationen einzelner Parameter oder eine gehäufte Zahl von Korrelationen zwischen TLRs und β-Defensinen in der Gruppe C (analog zu Tabelle 8) waren 24 bis 30 h p.p. nicht fest-zustellen.

Tabelle 11: Korrelationen der TLR- und β-Defensingen-Expression im Endometrium 24 bis 30 h p.p.

I. Gruppenübergreifend B + C (interkarunkuläres Endometrium, n=13-18) TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

II. Gruppe B (interkarunkuläres Endometrium, n=8-11)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

Tabelle 11 Fortsetzung

III. Gruppe C (interkarunkuläres Endometrium, n=5-7)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

IV. Gruppenübergreifend B+C (karunkuläres Endometrium, n=9-15) TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

V. Gruppe B (karunkuläres Endometrium, n=6-10)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

VI. Gruppe C (karunkuläres Endometrium, n=3-5)

TLR3 TLR4 TLR6 TLR9 BNBD5 uDef

Spearman-Korrelationskoeffizienten der TLR- und β-Defensingen-Expression im interkarunkulären (IE) und karunkulären Endometrium (KE) unabhängig von Art der Fruchtentwicklung (B+C) und abhängig von der Art der Fruchtentwicklung (B, C). Signifikante, hoch-korrelierte Beziehungen sind mit einem Stern (*) ausgezeichnet (*p<0,001; r>0,7).

4.3 Postpartale Modulation der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im bovinen Endometrium

Da sich die Expressionsstärken wie auch die Korrelationen direkt nach Fruchtentwicklung (siehe 4.1) von denen, die 24 bis 30 h p.p. erfasst wurden (siehe 4.2), unterschieden, wurde im Folgen-den die Stärke der Expressionsänderung der einzelnen Parameter innerhalb der ersten 24 bis 30 h nach Fruchtentwicklung untersucht. Im Speziellen wurde der Frage nachgegangen ob dies in Ab-hängigkeit vom Zeitpunkt des Trächtigkeitsendes bzw. der Art der Fruchtentwicklung geschieht.

Um die Art und Stärke der Expressionsänderung zu beleuchten, wurden für jedes Einzeltier Dif-ferenzen zwischen der Expression 24 bis 30 h p.p. und der Expression unmittelbar nach Frucht-entwicklung gebildet.

Es bestanden große interindividuelle Unterschiede in der Expressionsänderung der einzelnen Parameter. Dies führte dazu, dass keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Expressions-änderung, sowohl im Vergleich zwischen der ersten und zweiten Probennahme als auch im Ver-gleich zwischen den Gruppen festzustellen waren (Kruskal Wallis Test, Werte nicht dargestellt).

Tendenziell reagierten in der Gruppe C fast alle Probanden mit einer Heraufregulation aller un-tersuchten Parameter im interkarunkulären Endometrium (Abbildung 10). In der Gruppe B war für TLR2, 3, 6 und BNBD5 überwiegend eine Herabregulation der Expression zu beobachten.

Bei TLR4 reagierte etwa die Hälfte der Individuen mit einer Heraufregulation des Erregererken-nungsrezeptors, während die anderen mit einer Verminderung der Expressionsstärke reagierten.

Bei uDef kam es eher zu einer Verstärkung der Expression (Abbildung 10). Im Gegensatz zu den genannten Genen war für TLR9 bei beiden Gruppen annähernd keinerlei Expressionsänderung zu erkennen (Abbildung 10).

Somit war uDef als Effektormolekülgruppe der einzige Parameter, der sowohl bei der subparta-len Gruppe B als auch bei der unmittelbar postpartasubparta-len Gruppe C tendenziell in der Expression gesteigert wurde, wohingegen alle anderen Parameter im interkarunkulären Endometrium (IE), außer TLR9, bei Gruppe C tendenziell verstärkt und in der Gruppe B vermindert exprimiert wurden.

Abbildung 10: Expressionsänderung der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression in den ersten 24 bis 30 h p.p. im interkarunkulären Endometrium

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die Änderungen der TLR- und β-Defensingen-Expression (in Kopienzahl pro 75 ng mRNA) bei Tieren der Gruppe B und C (Tabelle 3); innerhalb der ersten 24 bis 30 h p.p. im IE. Es liegen keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen den Geweben vor (° = milde „Ausreißer“, * = extreme „Ausreißer“ (Abbildung 4) (Kruskal Wallis Test, Signifikanzschwelle p<0,0025). Die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen waren nicht signifikant.

Im karunkulären Endometrium beider Gruppen waren außer TLR9 und TLR3 die untersuchten Gene der Parameter tendenziell verstärkt exprimiert (Abbildung 11). Dabei fiel die Expressions-steigerung in Gruppe C höher aus als in Gruppe B (Abbildung 11). Es gab in Gruppe C jedoch ein Individuum, das entgegen dem Rest der Gruppe mit einer deutlichen Expressionsverminde-rung der meisten Parameter reagierte (TLR2, 4, 6 und uDef; Ausreißerwerte in Abbildung 11).

Bemerkenswert war auch, dass das Reaktionsspektrum der Expressionssteigerung bei dem Effek-torparameter BNBD5 in der Gruppe C einen sehr viel größeren Bereich umfasste als in der Gruppe B. Im Gegensatz zu der zum Teil immensen Expressionssteigerung von uDef in Gruppe B im interkarunkulären Endometrium waren die Veränderungen im karunkulären Endometrium bei beiden Gruppen nur ein 10tel so stark (Abbildung 10 und Abbildung 11).

Abbildung 11: Expressionsänderung der Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression in den ersten 24 bis 30 h p.p im karunkulären Endometrium

Dargestellt als Boxplots (Abbildung 4) sind die Änderungen der TLR- und β-Defensingen-Expression( in Kopienzahl pro 75 ng mRNA) bei Tieren der Gruppe B und C (Tabelle 3); innerhalb der ersten 24 bis 30 h p.p. im KE. Es liegen keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen den Geweben vor (° = milde „Ausreißer“, * = extreme „Ausreißer“ [Abbildung 4], Kruskal Wallis Test, Signifikanzschwelle p<0,0025). Die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen waren nicht signifikant.

Korrelationen innerhalb der TLR- und β-Defensingen- Modulation

Da viele der erfassten Parameter sich tendenziell in der Expressionsstärke innerhalb der ersten 24 bis 30 h nach der Fruchtentwicklung veränderten, wurde im Folgenden untersucht, ob die Ex-pressionsänderung einzelner Parameter miteinander korreliert. Aufgrund zum Teil geringer Gruppengrößen wurden auch hoch korrelierte Daten (r>0,7) mit berücksichtigt, die auf dem Niveau von p< 0,005 signifikant waren (Tabelle 12).

Am häufigsten ergaben sich Modulations-Korrelationen zwischen TLR2 und TLR4. Aber auch Korrelationen verschiedener Paramter mit TLR6 bestanden häufig. Auffällig ist dabei, dass Kor-relationen mit Defensinparametern vor allem im IE ausschließlich in der postpartalen Gruppe (C) vorlagen und nicht bei Kaiserschnitttieren (A, B). Die signifikanten Korrelationspaare sind der Tabelle 12 zu entnehmen.

Tabelle 12: Korrelationen der peripartalen Expressionsänderung der TLR und β-Defensingene im Endometrium

Dargestellt sind signifikante hoch korrelierte Zusammenhänge der Expressionsänderung der untersuchten TLR- und β-Defensingene innerhalb der ersten 24-30 h p.p. im interkarunkulären und im karunkulären Endometrium. Korrelationskoeffizienten nach Spearman. **: p<0,001; hoch korreliert (r>0,7); *: p<0,005;

hoch korreliert (r>0,7).

4.4 Einfluss bakterieller Kontaminationen auf die Toll-like-Rezeptor- und β-Defensingen-Expression im bovinen Endometrium

Im Folgenden wurde geprüft, ob unabhängig vom peripartalen Stadium, die postpartale bakerielle Kontamination des Uterus für unterschiedliche Expressionsdichten einzelner Rezeptoren oder Effektoren verantwortlich war.

Bei keiner im Rahmen eines Kaiserschnittes (Gruppe A und B) entnommenen Probe waren Keime festzustellen. Bei den nach Spontangeburt (Gruppe C) entnommenen Proben sowie bei den 24 bis 30 h p.p. gewonnenen Proben aller Gruppen konnte jeweils ein gemischtes bakterielles Keimspektrum nachgewiesen werden. Am häufigsten wurden Enterococcus spp., gefolgt von Escheri-chia coli (E. coli) nachgewiesen. Eine Zusammenstellung der gefundenen Keimspezies liegt in Abbildung 12 vor.

Ausgehend von der Zeitspanne der mikrobiellen Kontamination der Zielgewebe wurden neue Gruppen zusammengestellt und die Expressionsstärke der Parameter verglichen (Tabelle 4).

Enterococcus spp.

Abbildung 12: Nachweishäufigkeit einzelner Keimspezies in postpartalen endometria-len Gewebeproben

Untersucht wurden Endometriumsproben der Gruppe C (Beprobungszeitpunkt „unmittelbar nach Fruchtentwicklung“) sowie endometriale Proben der Gruppen B und C (Beprobungszeitpunkt „24 bis 30 h p.p.“).

4.4.1 Vergleich der TLR- und β-Defensingen-Expression im Zeitraum einer fri-schen mikrobiellen Kontamination

Es kommt im Verlauf der Geburt durch den geöffneten Zervixkanal sowie den Kontakt des Kal-bes während der Austreibungsphase mit der Außenwelt im Regelfall zu einer Kontamination des Geburtskanales und des Uterus mit bakteriellen Erregern (DOHMEN et al. 1995, BONDURANT 1999). Dieser Prozeß kann sich auch in den ersten Stunden und Tagen nach der

Im Dokument Peripartale Expression von Toll-like-Rezeptoren und [beta]-Defensinen im Endometrium des Rindes (Seite 62-99)