Lokal und zeitlich bedingte differentielle Expression von Toll-like-Rezeptor und β-

Zu dem von HERATH et al. (2006) zum ersten Mal publizierten TLR4-System in bovinen en-dometrialen Epithel- und Stromazellen konnten in dieser Arbeit erstmals die Genexpression von TLR2, TLR3, TLR6 und TLR9 sowie bovinen β-Defensinen im bovinen Endometrium nachge-wiesen werden. Der Nachweis gelang im KE und im IE sowie zu allen Beprobungszeitpunkten in der peripartalen Phase. Bei der Betrachtung des Einflusses der untersuchten peripartalen Stadien auf die TLRs und Defensine zeigte sich, dass sich deren Expression nur im karunkulären Endo-metrium zwischen den entsprechenden Versuchsgruppen unterschied (4.1.1und 4.1.2).

Im Gegensatz zum IE war hier eine tendenziell höhere Expressionsdichte fast aller gemessenen TLRs in der Gruppe C (unmittelbar post partum) festzustellen. Dies galt für TLR2, TLR3, TLR4 und TLR6, nicht dagegen für TLR9 (4.1.2). Die Expressionsdichte war dabei etwa doppelt so hoch wie bei den Tieren, die sich in der Endphase der Trächtigkeit (Gruppe A) oder in Geburt (Gruppe B) befanden (4.1.2). Ebenso verhielt es sich mit dem Defensin BNBD5 (4.1.2). Die β-Defensingruppe uDef wies dagegen keinerlei Unterschiede in der Expression zwischen den drei untersuchten peripartalen Zeitpunkten auf (4.1.2).

Die alleinige Expressionsmodulation im karunkulären Endometrium könnte mit Mechanismen der zu diesem Zeitpunkt stattfindenden Nachgeburtsablösung im Zusammenhang stehen, wo-hingegen die feto-maternale Verbindung bei den Tieren der beiden anderen Gruppen noch weit-gehend intakt ist.

Mit der Lockerung und Ablösung der Chorionzotten in den karunkulären Krypten werden eine Vielzahl von Faktoren und Mechanismen in Verbindung gebracht (SCHOON 1989). Präpartal wird zudem eine fortschreitende Hyalinisierung des Gefäßendothels und Fibrosierung des Gewe-bes beobachtet, die dem Lösen der fetalen Zotten aus den Krypten vorangeht (REICHERT 2005). In der Literatur gibt es jedoch keine Anhaltspunkte, ob dies zu Expressionsänderungen der TLRs und β-Defensine führen kann.

Denkbar ist aber auch, dass eine Verschiebung in der Zellzusammensetzung im KE für Expres-sionunterschiede mitverantwortlich ist. Die für die feto-maternale Kommunikation wichtigen, im Chorionepithel vorkommenden meist zweikernigen Trophopblast-Riesenzellen (TGCs) (SCHULZ u. MERCKT 1956, GRUNERT 1980, HAGER 1983, LAVEN u. PETERS 1996)

sind zum aktiven Übertritt in das maternale Karunkelepithel befähigt (WOODING u. WATHES 1980, SCHOON 1989). Daneben kommt es auch unter physiologischen Bedingungen zur leuko-zytären Infiltration in das Endometrium (HEUWIESER et al. 1986).

Zu bedenken ist auch, dass der Probennahme in Gruppe C ein vollständiger Geburtsvorgang inklusive massiver mechanischer Verformungen der Plazentome vorangegangen war. Diese er-folgt aufgrund wechselnder Druckbelastung durch Uteruskontraktionen und durch den Fetus während der Austreibungsphase (SCHULZ u. MERKT 1956). In den Gruppen A und B war dies aufgrund der fehlenden Austreibungsphase nicht der Fall. Die Bedeutung dieser mechanischen Vorgänge für die vorliegenden Untersuchungen ist schwer abschätzbar.

Funktionell sinnvoll erscheint es, dass in den Karunkelepithelzellen postpartal die TLR- und β-Defensinexpression heraufreguliert wird, um diesen Bereich besonders für die Erregerabwehr vorzubereiten. Aufgrund der Oberflächenvergrößerung des Epithels durch Freilegung der karun-kulären Krypten und Septen (LEISER 1975) ist hier die Kontakt- und Invasionsfläche für kon-taminierende Bakterien kurz post partum besonders groß. Die unmittelbar präpartal stattfindende Abflachung des Karunkelepithels bis zur fast vollständigen Auflösung (LEISER u.

KAUFMANN 1994) macht dieses Gewebe möglicherweise besonders empfänglich für eine bak-terielle Infiltration.

Gegenüber dem IE wurden in der antepartalen Gruppe A TLR2 und in der subpartalen Gruppe B TLR2 und TLR4 im KE statistisch signifikant vermindert exprimiert (4.1.3). Auch TLR3 und 6, jedoch nicht TLR9, zeigten bei den Gruppen A und B tendenziell eine niedrigere Expression im KE. Vergleichbar verhält es sich mit den beiden gemessenen Defensinparametern BNBD5 und der β-Defensin-Gruppe universelles Defensin (uDef). In der Gruppe C bestanden dagegen diese Unterschiede nicht (4.1.3).

In Verbindung mit der Beobachtung, dass in der Gruppe C die TLR im KE gegenüber den bei-den anderen Gruppen verstärkt exprimiert wurbei-den, stützt dies die Vermutung, dass erst mit oder nach der Geburt die TLRs speziell in Bereich der Karunkel in ihrer Expression verstärkt werden.

Interessanterweise wurde von BEIJARE et al. (2006) gezeigt, dass die TLR4-Expression in der humanen Plazenta um die Geburt höher ist als im ersten Trimester der Schwangerschaft. KIM et al. (2004) zeigten außerdem, dass die TLR2- und 4-Expression in der Plazenta des Menschen bei der Geburt erhöht ist. Ihre Befunde decken sich z.T. mit der relativ verminderten Expression von TLR2 und TLR4 bei Tieren der Gruppe A und B gegenüber der unmittelbar postpartalen der

Gruppe C (4.1.3). KIM et al. (2004) erklärten ihre Beobachtungen damit, dass die spontane Ge-burt an sich ein moderat inflammatorischer Prozess mit gesteigerter Produktion pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine ist und zitieren dafür die Beobachtungen von KEELAN et al. (1999). Als zweite mögliche Erklärung denken auch sie an einen prophylaktisch protektiven Vorgang, der das maternale Gewebe in einer für bakterielle Infektionen besonders empfänglichen Zeit, der Geburt, schützt. Als dritte Überlegung, weshalb gerade TLR4 gesteigert sein könnte, führen sie an, dass TLR4 bewiesenermaßen auch Wirts-eigene Liganden (Fibrinogen, Kollagen, Heat shock protein HSP60) erkennt (VABULAS et al. 2002), die alle bei Gewebever-letzungen (wie sie bei der humanen Geburt vorkommen), aber auch in der bovinen Karunkel im Zuge der fortschreitenden Hyalinisierug und Fibrosierung freigesetzt werden. So mag TLR4 nicht nur als Sensor für bakterielle Kontamination, sondern auch für den Wirt „gefährliche“ Verlet-zungszustände fungieren. Dagegen erklären BEIJARE et al. (2006) die bei der Frau gefundene erhöhte TLR4-Expression zur Zeit der Geburt mit einem verringerten Risiko, dass bei einem Abort ein nicht selbstständig überlebensfähiger Fetus geboren wird, gegenüber früheren Stadien der Schwangerschaft, so dass nun die Induktion einer Geburt einer bakteriellen Infektion vorzu-ziehen ist (das Auslösen von Aborten durch Bindung von LPS an TLR4 ist bereits von ELOVITZ et al. [2003] bei der Maus gezeigt). Diese Überlegungen könnten auch für das Rind zutreffen.

Zu den anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten TLRs liegen keine entsprechenden Stu-dien vor. Ihr tendenziell ähnliches Verhalten kann jedoch als Hinweis gewertet werden, dass sie während Trächtigkeit und Geburt ähnlich reguliert werden. Über Unterschiede zwischen endo-metrialen Lokalisationen (plazentar und para-plazentar) wurden bei den Experimenten im huma-nen System keine Untersuchungen angestellt. Im bovihuma-nen System ist dagegen bisher nur eine Re-gulation von TLR2 und TLR4 nach Ligandenkontakt gezeigt (PETZL 2005, HERATH et al.

2006, YANG et al. 2006).

Der Grund für die tendenziell unterschiedliche Expressionshöhe der beiden Defensinparameter zwischen den beiden endometrialen Lokalisationen ist weitgehend unklar. Bisher liegen nur Er-gebnisse über die Expression von BNBD5 beim Rind vor, nicht jedoch über andere Vertreter der Defensinparameter. Jedoch ist beim Mensch in uterinen Epithelzellen gezeigt worden, dass die β-Defensine (HBD1-3) sich unterschiedlich verhalten können. Jedoch wurde auch hier nur das Verhalten nach Antigenkontakt untersucht (GARCIA et al. 2001, LEHRER u. GANZ 2002, SCHUTTE u. MC CRAY 2002, SCHAEFER et al. 2005).

TLR9 zeigt bei der Betrachtung des Einflusses der peripartalen Dynamik keinerlei Expressions-unterschiede. Dies unterstützt die These, dass TLR2, 3, 4 und 6 wie auch die gemessenen β-Defensine einer speziellen peripartalen Dynamik bei der Kuh unterliegen und dass diese peripar-tale Regulation sich zwischen den beiden endometrialen Lokalisationen IE und KE unterschei-det, TLR9 dagegen keiner peripartalen Regulation unterliegt.

In der vorliegenden Arbeit konnten Zusammenhänge zwischen Expressionsänderungen einzelner in der Arbeit untersuchter Parameter gezeigt werden (4.1.4). Diese Korrelationen wurden vor allem in der postpartalen Gruppe C gefunden und stellen sich sehr heterogen dar (4.1.4). Dies könnte als Hinweis darauf gewertet werden, dass erst nach physiologisch determiniertem Ende der Trächtigkeit oder sogar nur unter der Vorraussetzung einer physiologisch ablaufenden Spon-tangeburt mit allen ihren komplexen Vorgängen TLRs und β-Defensine gezielt reguliert werden.

Mögliche Einflussfaktoren reichen dabei von mechanischen (z.B. verschiedene Druckverhältnis-se), hormonellen (z.B. Kortisol), genetischen, bis zu zellulären Faktoren (Einstrom von PMN in das Endometrium, Fibrosierung, Hyalinisierung und Absterben von Karunkelgewebe), die alle nur in der Gruppe C in natürlichem Ausmaß zum Tragen kamen. Ziel scheint es zu sein, den maternalen Organismus auf eine vorhandene oder unmittelbar bevorstehende mikrobielle Kon-tamination des Uterus vorzubereiten, wie sie im Laufe der Geburt bei über 90% der Kühe vor-kommt (DOHMEN et al. 1995, BONDURANT 1999). Welche der aufgeführten Faktoren dabei den Haupteinfluss haben, ist noch zu klären.

5.2.1 Unterschiede des endometrialen TLR- und β-Defensingen-Spektrums einen Tag post partum

Zum Zeitpunkt der zweiten Probennahme - etwa einen Tag post partum - lag bei allen Tieren eine bakteriologische Kontamination des Uterus vor. Dennoch waren Unterschiede in der TLR- und β-Defensingenexpression zwischen den drei Gruppen weiterhin festzustellen. Dies unter-mauert die These, dass der Organismus peripartal die Kapazität hat, auf eindringende Keime zu reagieren.

Auch einen Tag p.p. zeigte sich, dass im KE die Expression der untersuchten TLR- (mit Aus-nahme von TLR9) und β-Defensingene in der Gruppe C tendenziell am höchsten war (4.2.2).

Diese Sonderrolle von TLR9 wurde bereits bei anderen Autoren sowohl im bovinen System als auch in humanen uterinen Zellen gefunden. Dort zeigte sich eine Sonderrolle von TLR9 nach Ligandenkontakt. So zeigte PETZL (2005) nach experimenteller Infektion des Euters mit E. coli

oder S. aureus eine Expressionssteigerung von TLR2 und TLR4 wie auch BNBD5, jedoch nicht von TLR9. Ähnliches fanden GOLDAMMER et al. (2004) in Fällen natürlich auftretender Masti-tiden. Auch SCHAEFER et al. (2004) beobachteten, dass humane Epithelzellen zwar TLR1 bis 9 exprimieren, jedoch nur nach Stimulation mit TLR-Liganden von TLR2, TLR5 und in geringe-rem Maß TLR4 mit der Induktion von Chemokinen und/oder Zytokinen reagierten. Dies war jedoch bei Liganden von TLR3, TLR7 und TLR9 nicht der Fall. Dagegen fanden HUAZHANG et al. (2002) eine Verstärkung der Genexpression von TLR2, TLR4 und TLR9 nach LPS-Stimulation von murinen dendritischen Zellen. Auch SOBOLL et al. (2006) zeigten in humanem uterinen Gewebe, dass die Inkubation von Epithelzellen mit LPS, Pam3Cys, Poly (I:C) oder PGN sowohl die TLR9- wie auch TLR5-Expression induziert. Dagegen fanden diese Autoren keinen Effekt auf die TLR4- oder Defensin-Expression.

Ein Grund für die geringe Expression von TLR9 im karunkulären Endometrium in der vorlie-genden Studie könnte die Anwesenheit des Colony-Stimulating Factor-1 (CSF-1) sein. LEE et al.

(2003) zeigten dazu, dass bovines CSF-1 im Laufe der Trächtigkeit verstärkt exprimiert wird. Es wird besonders in den Epithelzellen der Mikrovilli der fetalen Kotyledonen und im maternalen karunkulären Gewebe exprimiert. Dies könnte dazu führen, dass die TLR9-Expression gerade im KE unterdrückt wird. Einen Einfluss könnte in diesem Zusammenhang auch die verzögerte Lö-sung der Nachgeburtsteile bei der Gruppe B gehabt haben (alle Tiere litten unter einer Nachge-burtsverhaltung), wohingegen in der Gruppe C bei allen Tieren die Nachgeburt bereits abgegan-gen war.

Im IE bestand nur ein tendenzieller Unterschied in der TLR3- und BNBD5-Expression (4.2.1).

Deren Expression war auch hier in der Gruppe C erhöht. Dies unterstützt wiederum die Beo-bachtung, dass sich die beiden endometrialen Lokalisationen in ihrer immunologischen Bedeu-tung unterscheiden. Warum die Effekte gerade bei diesen Parametern auftraten, bleibt unklar. So sind für TLR3 bisher nur virale Liganden bekannt.

Die Ausbildung eines bestimmten TLR-Spektrums mit Zusammenregulation einzelner Parameter zeigte sich in der vorliegenden Arbeit Gruppen- und Gewebe-unabhängig interindividuell sehr unterschiedlich (4.2.4) Dies kann auf eine genetische Komponente bei der Ausprägung eines in-dividuellen Expressionsmusters hindeuten. Ebenfalls denkbar ist ein dominierender Einfluss des heterogenen Erreger-Misch-Spektrums.

Dementsprechend liegt ein Interpretationsansatz im bekannten Phänomen der Änderung der TLR-Ligandenspezifität durch Zusammenlagerung und somit Expressionskoppelung verschiede-ner TLRs. Dies wurde für TLR6 mit TLR2 oder TLR1 gezeigt (UNDERHILL u. OZINSKY 2002). Inzwischen gilt auch eine Heterodimerbildung zwischen TLR2 und TLR1 (MASSARI et al. 2006) wie auch zwischen TLR2 und TLR4 (LEE et al. 2004) und zwischen TLR4 und TLR5 (MIZEL et al. 2003) als gesichert. Eine gezielte Heraufregulation einzelner TLRs nach Liganden-kontakt konnte in diesem Sinne bereits bei verschiedenen Autoren für TLR2, TLR4, TLR5 und TLR9 gezeigt werden (HUAZHANG et el. 2002, WOLFS et al. 2002, GOLDAMMER et al.

2004).

Letztendlich ist es jedoch schwierig, die Höhe der TLR- und β-Defensingen-Expression zu den einzelnen peripartalen Zeitpunkten und an den beiden Lokalisationen zu beurteilen, da es keinen Goldstandard, dafür aber starke interindividuelle Schwankungen gibt. Deshalb wurde die Auf-merksamkeit auf relative Veränderungen gelenkt. So wurden in einem weiteren Schritt die unmit-telbar nach Abbruch bzw. Ende der Trächtigkeit gemessenen Werte mit den 24 h später ermittel-ten in Beziehung gesetzt (s.u.).

5.2.2 Modulation der TLR- und β-Defensingene innerhalb des ersten Tages p.p.

Über die TLR- und β-Defensingen-Expression p.p. lagen bisher keinerlei Studien vor, dagegen ist die Expressionssteigerung von TLRs nach Antigenkontakt bereits vielfach beschrieben. (s.o.).

Obwohl es im vorliegenden Versuch bei allen Tieren p.p. zu einer gemischten bakteriellen Kon-tamination kam, verhielten sich die beiden Gruppen unterschiedlich in Bezug auf eine Regulation der TLR- und β-Defensingene im Zeitraum von 24 bis 30 h p.p.

Auch abhängig von der endometrialen Lokalisation ergaben sich Unterschiede. So zeigte im in-terkarunkulären Endometrium die bakterielle Mischkontamination die zu erwartende Expressi-onssteigerung verschiedener TLRs nur in der unmittelbar postpartalen Gruppe C. Dort wurden tendenziell alle gemessenen TLRs und Defensine in ihrer Expression gesteigert, jedoch wiederum außer TLR9 (4.3). In der Gruppe B dagegen wird nur die β-Defensingruppe uDef von allen Tie-ren in der Expression gesteigert. TLR2, TLR6 und das β-Defensin BNBD5 wurden dagegen ten-denziell herabreguliert (4.3). TLR4 wird unterschiedlich in der Expression verstärkt oder vermin-dert (4.3). Damit wird im IE nur uDef in beiden Gruppen innerhalb von 24 h p.p. tendenziell in der Expression gesteigert. Im karunkulären Endometrium zeigte sich ein anderes Bild. Hier

wur-den bei beiwur-den Gruppen die TLR- und beide Defensinparameter tenwur-denziell in der Expression erhöht (wiederum außer TLR9, TLR3 nur in geringem Maß) (4.3). Jedoch fiel diese Expressions-steigerung beider Gruppen sehr viel geringer aus als die im IE gefundene ExpressionsExpressions-steigerung der Gruppe C (4.3). Dies mag darauf zurückzuführen sein, dass die Expression im KE in dieser Gruppe bereits kurz postpartal (s.o.) erhöht war und der Anstieg deshalb nur noch geringgradig ausfiel. Im IE dagegen ist 24 bis 30 h p.p. zum ersten Mal eine Expressionserhöhung der TLRs und Defensine festzustellen. Damit reagieren im KE einen Tag nach Fruchtentwicklung beide Gruppen B und C mit einer Expressionssteigerung der meisten untersuchten Parameter. Dies kann als starker Hinweis auf eine entscheidende Rolle der TLR- und β-Defensinregulation bei der postpartalen Erregerelimination angesehen werden.

Zusammenhänge zwischen der Expressionssteigerung oder Verringerung einzelner Parameter ergaben sich am häufigsten zwischen TLR2 und TLR4 (4.3). In mehreren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl TLR2 als auch TLR4 in den verschiedensten Geweben bei unter-schiedlichen Spezies nach bakterieller Stimulation gemeinsam in ihrer Expression gesteigert wer-den (u.a. bei der Kuh: GOLDAMMER et al. 2004 und PETZL 2005, bei der Maus:

HUAZHANG et al. 2002 und WOLFS et al. 2002).

Eine Dimerbildung zwischen TLR2 und TLR4 wurde von LEE et al. (2004) gezeigt. Außerdem gibt es Arbeiten über die Rolle von Steroidhormonen bei der Regulation von TLR2 und TLR4 (5.4). Andere Einflussfaktoren, speziell in der frühen postpartalen Periode wurden bisher nicht untersucht.

5.3 Die bakterielle Kontamination hat einen Einfluss auf die Expression von