Nachweis der TLR- und β-Defensingen-Expression mittels quantitativer RT-PCR . 52

RNA-Gewinnung aus endometrialen Gewebestücken

Die Aufarbeitung der endometrialen Gewebeproben und Durchführung der PCR erfolgte freundlicherweise im Labor von Prof. H. M. Seyfert des Forschungsinstitutes für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) in Dummerstorf.

Die in RNA-Later^® (3.2) überführten Proben wurden mit Trizol^® Reagenz (3.2) entsprechend den Angaben des Herstellers aufgearbeitet.

Das Verfahren beinhaltete zunächst eine Homogenisation des Gewebes in Trizol^® (3.2; 1 ml Tri-zol^® je ~100 mg Gewebe), Inkubation des Homogenates für 5 min bei Raumtemperatur sowie Abtrennung des Zelldetritus durch Zentrifugation (12.000 x g; 5 min, 4°C).

Zur RNA-Aufreinigung wurden anschließend 0,2 Volumenanteile Chloroform zugesetzt und die Proben gründlich durchmischt (Vortex Schüttler (3.1), ca. 15 s). Zur Phasentrennung wurde die Probe im Anschluss abzentrifugiert (12.000 x g; 15 min, 4°C) und die RNA-haltige wässrige Pha-se in ein frisches Gefäß überführt. Hieraus wurde die RNA anschließend durch Zusatz von 0,5 Vol Isopropanol präzipitiert. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die RNA ab-zentrifugiert (12.000 x g, 10 min), 1mal mit 75% Alkohol gewaschen und nach kurzer Trocknung in sterilem, redestilliertem, RNase-freiem Wasser gelöst.

Die RNA-Konzentration wurde im Spektralphotometer bestimmt. Gemessen wurden die Ab-sorptionen bei 260 nm, 280 nm und 320 nm. Zur Mengenbestimmung wurde davon ausgegan-gen, dass RNA in einer Konzentration von 50 µg/ml bei einer Messwellenlänge von 260 nm eine Absorption von 1 Einheit verursacht, wenn die Schichtdicke 1 cm beträgt.

Formaldehyd-Agarose-Gel-Elektrophorese

Zur Bestimmung der Qualität der gewonnenen RNA wurde eine Formaldehyd-Agarose-Gel-Elektrophorese durchgeführt (in Abbildung 2 ist ein Agarosegel beispielhaft dargestellt). Dafür wurden alle erforderlichen Glasgefäße zur Vermeidung von Kontaminationen mindestens eine Stunde mit 0,1% DEPC-Lösung (3.2) inkubiert und anschließend, wie die verwendeten Lösun-gen, autoklaviert. Gel-Apparaturen, Polymerisierungsschalen und ähnliches wurden mit 0,2 N NaOH für 15 min inkubiert und vor Gebrauch mit 0,1% autoklaviertem DEPC-Wasser abge-spült.

Von den RNA-Proben wurden jeweils 5-10 μg Gesamt-RNA enthaltende Anteile entnommen.

Nach der Zugabe von 5x-RNA-Lade-Puffer im Verhältnis 1:4 wurden die Proben bei 65°C für 5 min denaturiert. Bevor die Proben dann für ca. 3 h bei einer Spannung von 5 bis 7 V/cm im elektrischen Feld aufgetrennt wurden, musste das 1,2% Formaldehyd-Agarose-Gel für eine halbe Stunde mit 1x-Formaldehyd-Lauf-Puffer equilibriert werden

Abbildung 2: Muster eines Formaldehyd-Agarose-Geles

Dargestellt ist ein Formaldehyd-Agarose-Gel nach Elekrophorese zur Qualitätsbestimmung der gewonnen Gesamt-RNA. (Die Pfeile markieren degradierte Proben.)

Reverse Transkription der RNA in cDNA:

1,5 µg der gewonnenen RNA wurde mithilfe der RT-PCR SuperScript III^® Reverse Transcriptase (3.2) nach dem Protokoll der Firma Invitrogen in cDNA umgewandelt.

In dem verwendeten Kit der Firma Invitrogen waren vorhanden:

Oligo(dT)₂₀ 50,0 µmol/l

dNTP Mix 10,0 mmol/l

RT Puffer 5 X

RNaseOUT^® 40,0 U/µl

SuperScript^® III RT 200,0 U/µl Dithiothreitol (DTT) 0,1 mol/l

RNase H 2,0 U/µl

Die Umwandlung in cDNA geschah unter folgendem Protokoll:

Die Arbeitsschritte wurden soweit nicht anders angegeben auf Eis ausgeführt. 1 µl RNA, aufge-nommen in 28 µl Wasser, wurde mit 2 µl Oligo(dT)₂₀ und 1 µl 10 mmol/l dNTP Mix versetzt und durch auf- und abpipettieren vorsichtig gemischt. Im Anschluss wurde die Probe für 5 min bei 70°C inkubiert. Diese Wärmebehandlung dient der Entfernung von Sekundärstrukturen der RNA. Die Probe wurde für 2 min auf Eis abgekühlt. Es wurden: 6 µl 5 x RT Puffer, 1 µl RNase-OUT^®, 1 µl SuperScript^® III RT und 1 µl 0,1 M DTT hinzugefügt und wieder durch vorsichtiges auf- und abpiptettieren gemischt.

Die Probe wurde bei 50°C im vorgeheizten Thermocycler (3.1) für 50 min inkubiert. Die reverse Transkriptase wurde im Anschluss bei 85°C für 5 min inaktiviert. Unter Zugabe von 1 µl RNase H (2 U/µl) folgte ein weiterer Inkubationsschritt bei 37°C für 20 min. Diese Reaktion wurde auf Eis gestoppt. Die gewonnene cDNA wurde entweder bei -20°C vorübergehend gelagert oder sofort weiterverarbeitet.

Aufreinigung der cDNA

Eine anschließende Aufreinigung der cDNA geschah mithilfe des „High Pure PCR Product Puri-fication Kit“ der Firma Roche (3.2) entsprechend der Anleitung des Herstellers. Eingesetzt wur-den 100 µl cDNA, die in das mitgelieferte hochreine Filterröhrchen gegeben wurwur-den. In diesem befand sich das Glasfasergewebe an das sich die cDNA mithilfe des mitgelieferten Bindungs-Puffers anlagern ließ. Die 100 µl der cDNA-haltigen Lösung wurden mit 500 µl Bindungspuffer versetzt, auf die Säule geladen und abzentrifugiert (7.500 x g, 45 s). Die adsorbierte cDNA wurde 2mal gewaschen (200- 500 µl) und anschließend mit 50-100 µl Wasser eluiert.

Genspezifische Primer

Die eingesetzten Oligonukleotidprimer sind in Tabelle 5 aufgelistet. Über ihren erfolgreichen Einsatz, die Prüfung der Spezifität aller Oligonukleotidprimer durch Klonierung und Sequenzie-rung der Amplifikate, berichtet YANG et al. (2006).

Tabelle 5: Primersequenzen gemessener Erregererkennungsrezeptoren (TLRs) und Ef-fektormoleküle (β-Defensine) mit zugehörigen Mess-Temperaturen

Gen Name Sequenz Mess uDef* Oligo(dT)20 5´-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTN cDNA Primer 80 uDef_r GAA ACA GGT GCC AAT CTG TCT C Messprimer uDef_f AGG CTC CAT CAC CTG CTC CT Messprimer

Aufgeführt sind die taq-Primer (cDNA Primer) und jeweiligen Forward (f)- und Reverse-Primer (r) (=Sense- und Antisense-Primer) der untersuchten TLRs und β-Defensine inklusive Mess -Temperaturen.

* erfasst die folgenden Produkte: LAP, EBD, BNBD4, BNBD5, LAP-artiges Protein.

Quantifizierung der cDNA mittels Realtime RT-PCR

Im Gegensatz zur semiquantitativen PCR kann bei der Real-Time PCR der gesamte Amplifi-kationsprozess verfolgt werden. Mit Hilfe einer Fluoreszenzdetektion, deren Intensität proporti-onal zur Menge des Amplikons zunimmt, kann so direkt auf die enthaltene Menge einer Nukleo-tidsequenz geschlossen werden. Es wurde das einfarbige Detektionssystem (SYBR green^®[“Fast Start DNA Master Plus SYBR green”; 3.2]) eingesetzt. SYBR green^® wird zur Fluoreszenz durch Einlagerung in neusynthetisierte Doppelstränge befähigt, was mit dem Amplifikationsprozess korreliert. So kann der Prozess verfolgt werden. Alle Gene wurden mit dem gleichen Tempera-turprogramm gemessen; die Mess-Temperatur wurde entsprechend den Primereigenschaften angepasst (Tabelle 5). Zur Bestimmung der ursprünglich eingesetzten Kopienzahl wurde die Me-thode der absoluten Quantifizierung anhand einer gegebenen Kalibrierkurve durchgeführt - ba-sierend auf einer Verdünnungsreihe von Plasmid DNA (Zählerplasmid). Diese wurde für jedes Gen gesondert entwickelt. Mithilfe der Zählerplasmide wurde jeweils eine Standardkurve erstellt, welche die Effizienz der Amplifikation widerspiegelt und zur Berechnung des Gehaltes notwen-dig ist. Es wurden folgende Verdünnungen verwendet: 1 x10⁶, 1x10⁵, 1x10⁴, 1x10³, 1x10² und 10 Kopien.

Die durch den linear verlaufenden Bereich der Amplifikationskurve gehende Linie wird als Schwellenwert = “threshold“ bezeichnet, der zum Erhalt eines Zahlenwertes zum Vergleich der Proben herangezogen (ct- Wert [„threshold cycle“]) wird. Daraus wurde mit MS Excel^® eine Standardkurve erstellt, bei der die ct- Werte gegen den Logarithmus der eingesetzten cDNA-Menge aufgetragen werden. Eine extrapolierte Gerade wird dann zur Berechnung der Proben verwendet (wenn r>0,99) Die Amplikons wurden jeweils mittels Agarosegelen auf korrekte Grö-ße kontrolliert und zusätzlich bei SYBR green^® PCRs durch die Analyse der Schmelzkurve identi-fiziert.

Real-Time Reaktionsansatz:

cDNA ~10,0 ng

Mastermix (mit Sybrgreen®) 2x 12,5 µl Forward-Primer (20 μmol/l) 0,25 μl Reverse-Primer (20 μmol/l) 0,25 μl

H²O ad 25,0 μl

Jede Probe wurde mindestens doppelt gemessen und dann auf die RNA-Einwaage bei der cDNA-Bereitung bezogen.

Die Polymerase Kettenreaktion wurde in Anlehnung an das Protokoll von SAMBROOK et al.

(1989) durchgeführt.

Die Ansätze zur Denaturierung der DNA wurden im Thermo-Cycler für 10 min auf 95°C erhitzt.

Nun wurde ein Temperaturprogramm gefahren, das sich aus der Oligonukleotid-Primer Anlage-rung (60°C; 10 s), der Elongation (72°C, 20 s, Messung bei ~80°C [siehe Tabelle 5], 5 s) und der Denaturierungsphase (95°C, 20 s) zusammensetzt. Dieser Zyklus lief weitere 40mal ab. Es folgte die Schmelzkurvenanalyse und eine Kühlphase.

Zur Kopienberechnung wurden die Ergebnisse mit Standardkurven verglichen. Hierfür wurden Serienverdünnungen der klonierten Amplifikate hergestellt (von 10 bis 1 Mio Kopien) und unter identischen Bedingungen im LightCycler^® gemessen.

3.5.7 Statistik

Als Maße für die Streuung der Werte wurden der Variationskoeffizient (Coefficient of Variation (CV)) und der Interquartilbereich (IQB) verwendet. Der CV berechnet sich aus dem Mittelwert geteilt durch die Standardabweichung und beschreibt in Prozent, wie weit die Daten um den Mit-telwert variieren. Der IQB stellt den Bereich bzw. den Abstand (IQR) zwischen dem ersten Quartil (25%) und dem dritten Quartil (75%) der geordneten Daten dar. Er wurde ebenfalls an-gegeben. Abbildung 3 stellt den IQR an einem Beispiel grafisch dar.

Abbildung 3: Graphische Darstellung des Medians und Interquartilsabstandes (IQR) anhand eines fiktiven Beispieles

Dargestellt ist die Position des Medians und des Interquartilsabstandes (IQR) anhand des Beispieles einer geordneten, nicht-normalverteilten Datenmenge.

Für einige graphische Darstellungen wurden Boxplots (Abbildung 4) gemäß SPSS-Definition erstellt (SPSS Inc, 2006). Als Box wird das durch das erste und dritte Quartil bestimmte Rechteck bezeichnet. Dieses enthält 50 % der Werte und seine Länge entspricht dem Inter-quartilbereich (IQB). Der horizontale Balken in der Box stellt den Median dar, welcher durch seine Lage innerhalb der Box einen Eindruck von der Schiefe der den Daten zugrunde liegen-den Verteilung vermittelt. Die “Whiskers“ (T-Balken oberhalb und unterhalb der Box) zeigen die Datenwerte innerhalb des fachen Interquartilsabstands. Werte außerhalb dieses 1,5-fachen Interquartilbereichs werden als milde Ausreißer bezeichnet und mit einem o darge-stellt. Werte, die außerhalb des dreifachen Interquartilsabstandes liegen, werden als extreme Ausreißer bezeichnet und mit einem * abgebildet.

Abbildung 4: Erläuterungen zum „Box-Plot“

Dargestellt ist der Aufbau eines Boxplots mit Whiskers und Ausreißern. Die Box enthält 50 % der Werte und wird durch das erste und dritte Quartil der Daten bestimmt. Ihre Länge entspricht dem Interquartil-bereich (IQB). Der horizontale Balken in der Box stellt den Median dar. Die “Whiskers“ (die T-Balken oberhalb und unterhalb der Box) zeigen die Datenwerte innerhalb des 1,5-fachen Interquartilsabstands. o bezeichnet Werte außerhalb dieses 1,5-fachen Interquartilbereichs (milde Ausreißer). * bezeichnet Werte außerhalb des dreifachen Interquartilsabstandes (extreme Ausreißer).

Die vorliegenden Daten waren zum Großteil nicht normalverteilt. Aus diesem Grund wurden zur statistischen Analyse nicht-parametrische Tests eingesetzt. Dabei wurde beim Vergleich von zwei Datengruppen der Mann-Whitney U-Test durchgeführt und bei Vorliegen von mehr als zwei Gruppen der Kruskal-Wallis-Test benutzt (BORTZ 2005). Nachdem im Rahmen der Arbeit pro Auswertung multiple Parameter auf signifikante Unterschiede oder Zusammenhänge untersucht wurden, und damit das Risiko falsch-signifikante Unterschiede zu finden proportional steigt, wurde bei den entsprechenden Tests eine einfache Bonferroni-Korrektur angewandt, bei der der p-Wert durch die Anzahl der durchgeführten Tests dividiert wird. Dadurch werden überhöhte Signifikanzangaben weitestgehend vermieden (BORTZ 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde das Signifikanzniveau durchgehend auf 0,0025 reduziert. Nur wenn der p-Wert eines statistischen Tests kleiner als dieses Signifikanzniveau war, wurde der Test als signifikant bezeichnet.

Um den Zusammenhang zwischen zwei Variablen zu untersuchen, wurde der Korrelationskoeffi-zient nach Spearman („r“) berechnet, da die Daten nicht normalverteilt waren (BORTZ 2005).

Auch bei den Korrelationen wurde wieder eine Bonferroni-Korrektur angewandt. Korrelationen wurden nur als signifikant bezeichnet, wenn der p-Wert weniger als 0,001 betrug. Nur wenn der Korrelationskoeffizient mindestens 0,7 betrug, wurde von einer „hohen“ Korrelation zwischen zwei Parametern gesprochen.