3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Patienten – gesunde Kontrollgruppe
Im Rahmen der zwei vorliegenden Studien wurden bei insgesamt 15 Hunden mit Milzläsionen und 32 Hunden mit Gesäugetumoren aus der Klientel der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der Georg-August-Universität Göttingen die VEGF Serumkonzentration bestimmt.
In der Gruppe der Hunde mit Milzläsionen (n=15) stellten Mischlinge (n=5) die größte Gruppe dar. Die übrigen 10 Hunde setzten sich aus unterschiedlichen Rassen zusammen: Golden Retriever (n=2), Deutscher Schäferhund (n=1), Australian Sheperd (n=1), Hovawart (n=1), Border Collie (n=1), Langhaar Teckel (n=1), Riesenschnauzer (n=1), Kromfohrländer (n=1) und Jack Russell Terrier (n=1). 10 der 15 Hunde waren männlich. Davon waren 7 Rüden männlich-intakt und 3 Rüden männlich-kastriert. 5 Hunde waren weiblich. Davon waren 3 Tiere weiblich-intakt und 2 Tiere weiblich-kastriert. Die Hunde mit Milzläsionen waren zwischen 5 und 14 Jahren alt, das mittlere Alter betrug 12 Jahre. 12 der 15 Hunde waren über 9 Jahre alt.
Bei den Hunden mit Gesäugetumoren (n=32) stellten Mischlinge (n=13) ebenfalls die größte Gruppe dar. Des Weiteren waren unterschiedlichste Rassen beteiligt: Golden Retriever (n=4), Deutscher Schäferhund (n=2), Bayerischer Gebirgsschweißhund (n=2), Altdeutscher Hütehund (n=2), Labrador Retriever (n=1), Boxer (n=1), Border Collie (n=1), Beagle (n=1), Pudel (n=1), Deutsche Wachtel (n=1), Katalanischer Schäferhund (n=1), Deutsch Kurzhaar (n=1) und Schapendoes (n=1). 5 der 32 Hündinnen waren weiblich-kastriert und 27 Hunde weiblich-intakt. Die Hunde mit Gesäugetumoren waren zwischen 3 und 16 Jahren alt und das mittlere Alter betrug 10 Jahre.
Zusätzlich zur Messung der VEGF Serumkonzentration wurde bei den erkrankten Hunden eine hämatologische und klinisch-chemische Blutuntersuchung durchgeführt. Hunde mit Milzläsionen wurden nur in die Studie aufgenommen, wenn histopathologisch ein
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Hämangiosarkom oder Hämatom vorlag. Die Blutprobenentnahmen erfolgten stets vor dem chirurgischen Eingriff (Splenektomie bzw. Mastektomie) aus der V. cephalica antebrachii.
Als gesunde Kontrollgruppe dienten 23 Hunde unterschiedlicher Rasse und unterschiedlichen Alters: Mischlinge (n=9), Deutscher Schäferhund (n=3), Jack Russell Terrier (n=2), Rhodesian Ridgeback (n=1), Weimaraner (n=1), Bayerischer Gebirgsschweißhund (n=1), Australian Shepherd (n=1), Bearded Collie (n=1), Briard (n=1), Dalmatiner (n=1), Hovawart (n=1) und Entlebucher Sennenhund (n=1). 12 der 23 Hunde waren weiblich. Davon waren 7 Tiere weiblich-intakt und 5 Tiere weiblich-kastriert. Die übrigen 11 Hunde waren Rüden. 8 Tiere waren intakt und 3 Tiere männlich-kastriert. Die gesunden Hunde waren zwischen 7 Monaten und 13 Jahren alt, das mittlere Alter entsprach 5 Jahren. Diese wurden einer klinischen Allgemeinuntersuchung sowie einer abdominalen Ultraschalluntersuchung unterzogen. Labordiagnostisch wurden zusätzlich eine hämatologische Untersuchung (Leukozytenzahl, Zahl der neutrophilen Granulozyten, der Lymphozyten, der Monozyten, der eosinophilen Granulozyten, der basophilen Granulozyten und der Erythrozyten, Hämoglobin, Hämatokrit, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), Thrombozyten) und eine klinische Chemie (Glucose, Fructosamin, Gallensäuren, Glutamatdehydrogenase, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase, Gesamt-bilirubin, alkalische Phosphatase, Gesamteiweiß, Albumin, Kreatinin, Harnstoff, Calcium, Phosphor, alpha-Amylase, Cholesterin, Lipase, Kreatinkinase, Kalium, Natrium, C-reaktives Protein, Globuline) angefertigt. In die Kontrollgruppe sind nur klinisch gesunde Hunde aufgenommen worden.
25 3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.2.1 Geräte
Zentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5424 (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)
Zentrifuge: Hettich EBA 20 (Fa. Hettich, Bäch, Schweiz)
Analyseautomat klinische Chemie: Konelab 20i (Fa. Thermo Fischer Scientific Inc., Dreieich)
Analyseautomat Hämatologie: Abbott Cell-Dyn®3700 (Fa. Abbott GmbH & Co KG, Wiesbaden)
Vortexer: Vortex-Genie 2 (Fa. Scientific Industries, New York)
Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten: Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC, Wiesbaden)
Multifunktionslesegerät: TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich)
Pipettierhilfe: pipetus®-akku (Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt)
Pipetten: Pipetman P100/P200/P1000 (Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
Mehrkanalpipette: Pipetman Ultra Multichannel (20-300µl, Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
Multipipette: Eppendorf Multipipette® plus mit Combitips® plus in den Volumengroßen 2,5 und 5ml (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)
3.2.2 Verbrauchsartikel
Serumröhrchen: Microtube 1,3 ml mit Serum-Gerinnungsaktivator (Fa. Sarstedt AG &
Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die klinische Chemie sowie für die Bestimmung von VEGF aus Serum
EDTA K-Röhrchen: mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereicherte 2 ml Polypropylenröhrchen (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die Hämatologie sowie für die Bestimmung von VEGF aus Plasma
Reagiergefäße: Sarstedt-Reagiergefäß 1,5 ml (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht)
26 3.2.3 Reagenzien und Lösungen
Reagenzien und Lösungen des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ CAVE00 (Fa. R & D Systems, Minneapolis, USA):
Mikrotiterplatte, beschichtet mit einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF
VEGF-Konjugat:
o Polyklonaler Antikörper gegen VEGF, an Meerrettichperoxidase konjugiert
VEGF-Standard:
o Rekombinantes VEGF in einer gepufferten Proteinbasis
Assay Diluent RD1W: Gepufferte Proteinlösung zur Blockierung unspezifischer Bindungen und zur Herstellung eines äquimolaren Milieus
Calibrator Diluent RD6U:
o Mit Konservierungsmitteln versehenes Tierserum zum Auflösen des VEGF Standard, zur Herstellung der Verdünnungsreihe und als Negativkontrolle
Waschpufferkonzentrat
3.3 Gewinnung und Verarbeitung der Proben 3.3.1 Blutgewinnung
Die Blutabnahme erfolgte bei allen erkrankten Hunden im Rahmen der präoperativen Vorbereitung am unsedierten Tier. Nach dem Scheren und Desinfizieren der entsprechenden Hautstelle wurde den Hunden aus der V. cephalica antebrachii mittels Punktion mit einer sterilen Einmalkanüle 20G 0,9 x 40 mm (Fa. Terumo, Leuven, Belgien) Blut entnommen.
Zur Anfertigung der hämatologischen Untersuchung wurde Blut in ein mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereichertem Polypropylenröhrchen aufgefangen und mittels eines automatischen Auszählverfahrens ausgewertet (Abbott Cell-Dyn 3700). Das für die klinische Chemie benötigte Blut wurde in Serumröhrchen aufgefangen und im Anschluss in einer Eppendorf Centrifuge 5424 bei 3000 Umdrehungen/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem Pipetman P1000 abpipettiert und im Konelab 20i photometrisch bestimmt.
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Die Blutproben für die Bestimmung von VEGF aus Serum wurden jeweils in Serumröhrchen aufgefangen. Für die Bestimmung von VEGF aus Plasma wurden mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereichertem Polypropylenröhrchen genutzt. Alle Blutproben wurden im Anschluss weiter bearbeitet.
3.3.2 Aufbereitung der Proben
VEGF wird sowohl aus Serum als auch teilweise aus Plasma bestimmt. Für die Messung aus Serum müssen die Blutproben zunächst 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen. Im Anschluss wird das Blut mit der Eppendorf Centrifuge 5424 für 30 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert. Das Serum wird daraufhin mit einem Pipetman P200 abpipettiert. Das Serum wird aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
Für die Gewinnung von Plasma wurde EDTA-Blut herangezogen. Dieses wird innerhalb von 30 Minuten nach Gewinnung für 30 Minuten bei 1000 x g in der Zentrifuge Hettich EBA 20 zentrifugiert. Danach wird der Überstand abpipettiert, aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
3.3.3 Prinzip des ELISA zur Bestimmung von VEGF
Bei dem Testsystem „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ (Fa. R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) handelt es sich um einen Sandwich-ELISA, der die quantitative Bestimmung von VEGF ermöglicht. Die Mikrotiterplatte ist mit Antikörpern beschichtet. Im Falle des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für VEGF ist. In einem ersten Schritt wird ein Probenverdünnungsmittel (Assay Diluent) in jedes Well pipettiert. Im Anschluss folgen dann Standards und Proben. Vorhandenes VEGF wird nun an die immobilisierten Antikörper gebunden. Es schließt sich ein Waschvorgang an, bei dem alle ungebundenen Substanzen entfernt werden. In der Folge wird ein enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der spezifisch für das bereits im ersten Schritt immobilisierte VEGF ist, hinzugegeben. Dieser bindet an die bestehenden VEGF-Antikörper-Komplexe. Nach einem weiteren Waschvorgang, bei dem nicht gebundene enzymgekoppelte Antiköper entfernt werden, wird eine Substrat-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Die an den polyklonalen Antikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase reagiert mit dem Substrat. Die enzymatische Reaktion führt zu einem Farbumschlag. Es entsteht der blaue Farbstoff Tetramethylbenzidin. Die Intensität der daraus resultierenden Färbung ist proportional zur Menge des im ersten Schritt gebundenen Analyten. Die Farbreaktion wird durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt. Die blaue Farbe schlägt dabei nach Gelb um. Anschließend wird die optische Dichte eines jeden Wells mit einem Photometer gemessen.
28 3.4 Durchführung des ELISA
3.4.1 Testdurchführung „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“
Vor der Durchführung des ELISA werden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht.
Daraufhin werden die Waschlösung sowie der Standard vorbereitet. Für die Waschpufferlösung werden 20 ml des Waschpufferkonzentrates mit 480 ml deionisiertem Wasser vermischt. Der lyophilisierte VEGF-Standard wird in 1 ml Calibrator Diluent RD6U gelöst und für mindestens 15 Minuten stehen gelassen. Es entsteht eine Stammlösung mit einer Konzentration von 2500 mg/ml. Aus dieser Stammlösung wird anschließend eine 2-fache Verdünnungsreihe hergestellt. Dazu werden in 6 Reagiergefäße jeweils 500 µl Calibrator Diluent RD6U vorgelegt. In das erste Reagiergefäß werden außerdem 500 µl der Stammlösung gegeben und gründlich vermischt. Aus diesem Gemisch werden wiederum 500 µl Lösung in das nächste Gefäß übertragen. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt und so entsteht eine Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 313 pg/ml, 156 pg/ml, 78,1 pg/ml und 39,1 pg/ml. Der unverdünnte VEGF-Standard dient als höchster Standard mit 2500 pg/ml, der Calibrator Diluent RD6U dient als Negativkontrolle mit einer Konzentration von 0 pg/ml.
Danach wird mit der eigentlichen Testdurchführung begonnen. In jedes Well der Mikrotiterplatte werden 100 µl eines Probenverdünnungsmittels (Assay Diluent RD1W) gegeben. Im Folgenden werden jeweils 100 µl Standard oder Proben in die Wells pipettiert und die Platte mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt. Es folgt eine zweistündige Inkubationsphase bei Raumtemperatur. Anschließend folgt ein dreimaliger Waschvorgang.
Dafür wird der Inhalt der Wells zunächst ausgeschüttet und die Wells mit je 400 µl Waschlösung befüllt. Die Befüllung erfolgt mittels des Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC, Wiesbaden). Zur vollständigen Entfernung der Waschlösung nach dem Ausschütten, wird die Mikrotiterplatte auf ein sauberes Papiertuch geklopft. Im Anschluss werden in jedes Well 200 µl VEGF-Konjugat pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer neuen selbstklebenden Folie abgedeckt und erneut für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgt wieder ein dreimaliger Waschvorgang mit Waschpufferlösung. Dann werden 200 µl Substratlösung in jedes Well gegeben. Die Substratlösung wird zuvor aus zwei gleichvolumigen Farbreagenzien (Farbreagenz A und B) hergestellt. Die Substratlösung muss innerhalb von 15 Minuten nach deren Ansatz verwendet werden. Die Mikrotiterplatte wird erneut mit einer frischen selbstklebenden Folie versehen. Es folgt eine 25-minütige Inkubationszeit, die vor Licht geschützt stattfinden muss. Nach Ablauf der 25 Minuten wird die Farbreaktion durch die
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Zugabe von 50 µl Stopplösung je Well unterbrochen. Die Messung der optischen Dichte soll innerhalb von 30 Minuten nach Abstoppen der Farbreaktion erfolgen. Die Messung erfolgte mithilfe des TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm.
3.5 Auswertung
3.5.1 Auswertung des ELISA
Die Auswertung der detektierbaren Farbreaktion erfolgte photometrisch mit Hilfe des TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm. Aus der sich hier ergebenden optischen Dichte wurde die Konzentration von VEGF rechnerisch ermittelt.
3.6 Histopathologie
Von den Patienten wurde im Rahmen der Studie Operationsmaterial zur histologischen Diagnostik gewonnen und an die Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen (Leiter: Prof. Dr. F.-J. Kaup) zur weiteren Bearbeitung verschickt.
Das in 4 % Formalin fixierte Gewebemateriall wurde routinemäßig in Paraffin im Automaten Shandon Excelsior ES (Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) eingebettet, nach laborüblichen Protokoll geschnitten und mit Haematoxylin-Eosin ebenfalls im Automaten (Varistain Gemini, Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) gefärbt. Nach Eindecken der Glasobjekträger mit Eukitt wurden die Proben von Fachtierärzten für Pathologie befundet.
3.7 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Programme SAS-Sytem (Version 9.3, SAS Institute, Cary, NC, USA) und Statistika (Version 10.0; StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).
Unterschiede zwischen den Gruppen „Hunde mit Milzläsionen/Hunde mit Gesäugetumoren“
bzw. „gesund“ wurden mit dem Fisher´s Exact Test untersucht.
Für den Vergleich der VEGF Konzentrationen zwischen Hunden mit Milzläsionen und gesunder Kontrollgruppe sowie zwischen Hämangiosarkom- und Hämatompatienten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet.
Zur Beurteilung von Korrelationen wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman angewendet.
Die statistische Signifikanz wurde bei p-Werten < 0,05 angenommen.
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4 Ergebnisse
Die vorliegenden Ergebnisse wurden in zwei Manuskripten dokumentiert. Das erste Manuskript beschreibt die Messungen zu VEGF im Zusammenhang mit dem Auftreten von Milzveränderungen und vergleicht die Werte von Hämaniosarkomen und Hämatomen. Das zweite Manuskript geht auf den Zusammenhang zwischen VEGF und Mammatumoren ein.
4.1 MANUSKRIPT I
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemangiosarcoma and haematoma
Meike Frenz1, Franz-Josef Kaup2, Stephan Neumann1
1Tierärztliches Institut, Universität Göttingen, Burckhardtweg 2,
37077 Göttingen, Germany
Tel.: 0551-3933387; Fax : 0551-3913919;
Email: meike.frenz@googlemail.com
2Deutsches Primatenzentrum, Göttingen, Kellnerweg 4,
37077 Göttingen, Germany
31 4.1.1 Abstract
Splenic haemangiosarcoma are frequently seen in dogs. Because of their bad prognosis differentiation from other benign splenic lesions are of prognostic importance.
However, because haemangiosarcoma is a tumour of the vascular system, we hypothesized that vascular endothelial growth factor (VEGF) may play a major role in tumour growth and might thus be increased in the blood of affected dogs.
The aim of this study was to investigate the clinical relevance of differences in serum VEGF concentrations between dogs with splenic haemangiosarcomas and those with non-malignant splenic lesions (haematomas) and healthy subjects using a canine ELISA.
Serum VEGF levels were significantly higher in dogs with splenic masses compared with healthy dogs, but did not differ significantly between dogs with haemangiosarcomas and haematomas.
VEGF has a potential clinical utility as a diagnostic marker for dogs with splenic lesions but may not be useful to differentiate among the various splenic lesions.
Keywords: Vascular endothelial growth factor, Dog, Haemangiosarcoma, Angiogenesis, Spleen, Canine ELISA
4.1.2 Introduction
Angiogenesis is controlled by a multitude of pro- and anti-angiogenic factors. It is essential for tumour growth, especially in tumours greater than 2-3 mm in diameter, in which growth depends on adequate supplies of oxygen and nutrients (Folkman, 1985). Angiogenesis also plays a role in metastasis by providing routes for the dissemination of tumour cells (Folkman, 1975, 1995).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a dimeric heparin-binding glycoprotein and is one of the most potent angiogenic growth factors. It is an endothelial-cell-specific mitogen that increases vascular permeability, and is also a survival factor for endothelial cells (Ferrara, 2004). Ferrara (1999) reported that VEGF is a fundamental regulator of normal and abnormal angiogenesis. It is produced and secreted by several cell types including platelets,
32
lymphocytes, neutrophils, macrophages, smooth muscle cells and fibroblasts (Ferrara et al., 1991; Berse et al., 1992). Cellular VEGF expression is stimulated by a variety of factors including hypoxia, inflammatory cytokines, growth factors, hormones and oncogenic mutations, though oxygen tension appears to play a key role in VEGF up-regulation (Ferrara, 2004). VEGF is expressed by a variety of tumors in humans, and high serum levels are often associated with tumor progression, the presence of metastasis, poor prognosis and poor treatment response (Salven et al., 1997; 1998; George et al., 2000; Shimada et al., 2001;
Cooper et al., 2002; Karayiannakis et al., 2002). In addition to tumour cells, tumour-associated stromal cells also secrete VEGF (Fukumura et al., 1998).
Increased serum and/or plasma VEGF concentrations have been found in dogs with haemangiosarcoma, mammary gland tumours, osteosarcoma, lymphoma and other tumour types, suggesting that it may play a role in canine tumour growth and metastasis (Clifford et al., 2001; Gentilini et al., 2005; Kato et al., 2007; Taylor et al., 2007; Thamm et al., 2008;
Sobczynska-Rak, 2009).
VEGF may therefore represent a potential diagnostic marker of malignancy and may have particular relevance in haemangiosarcomas, which are highly malignant and highly vascularised tumours arising from the vascular endothelium. Furthermore, the presence of systemic metastases and local infiltration occur early in the disease, with the lung and liver being the most frequently affected organs (Brown et al., 1985; Hosgood, 1991).
Haemangiosarcomas are the most frequent malignant splenic neoplasms in dogs, and represent about 50% of all splenic neoplasms. However, non-neoplastic or benign lesions occur in over 50% of cases. Non-neoplastic lesions are primarily haematomas or hyperplastic nodules, which are often associated (Prymak et al., 1988; Spangler and Culbertson, 1992; Spangler and Kass, 1997).
The better prognosis of non-neoplastic lesions means that it is clinically relevant to distinguish between malignant and non-malignant splenic masses. There is currently no established method for differentiating between haemangiosarcoma and other splenic lesions, prior to histopathological analysis.
Abdominal radiography and ultrasonography are useful methods for identifying lesions in the spleen when they reach a certain size, but non-malignant splenic lesions such as haematomas, hyperplastic nodules or haemangiomas often appear identical to haemangiosarcomas. In addition, non-invasive fine-needle aspiration of splenic masses is difficult and has a poor sensitivity (Ballegeer et al., 2007).
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Now, Campos et al. (2012) reported significantly higher VEGF expression in splenic haemangiosarcomas than splenic haemangiomas.
This study therefore investigated the ability of serum VEGF levels to differentiate between splenic haemangiosarcomas and other non-malignant splenic masses in dogs using a canine commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
4.1.3 Materials and methods 4.1.3.1 Animals and samples
Fifteen dogs with splenic masses treated in the Small Animal Clinic of the University of Göttingen were investigated in this prospective study. All dogs underwent splenic surgery with resection of the organ. Dogs with a histological diagnosis of haemangiosarcoma or haematoma were included in the study. Serum samples for measurement of VEGF levels were collected from the cephalic vein prior to surgery.
The dogs with splenic masses were of several different breeds: mixed breed (=5), Golden Retriever (=2), German Shepherd (=1), Australian Shepherd (=1), Hovawart (=1), Border Collie (=1), Dachshund (=1), Giant Schnauzer (=1), Krom (dog) (=1), Jack Russell (=1). The median age of the dogs was 12 years (range, 5-14 years), and 12 of 15 dogs were older than 9 years. Ten male (seven intact and three neutered) and five female (three intact and two neutered) dogs were investigated.
Eight dogs had haematomas and seven had haemangiosarcomas in the spleen. One dog with a haematoma showed simultaneous hyperplastic nodules in the spleen, and three dogs with haemangiosarcomas showed metastases in the liver.
The control group consisted of blood samples from 23 dogs confirmed as healthy based on a physical examination, clinical pathology (complete blood count (CBC), serum chemistry) and abdominal ultrasonography. The control group consisted of 12 female (seven intact and five neutered) and 11 male (eight intact and three neutered) dogs with a median age of 5 years (range, 7 month-13 years). The breeds were: mixed breed (=9), German Shepherd (=3), Jack Russell (=2), Rhodesian Ridgeback (=1), Weimaraner (=1), Bavarian Mountain Scenthound (=1), Australian Shepherd (=1), Bearded Collie (=1), Briard (=1), Dalmatian (=1), Hovawart (=1), and Entlebuch Mountain Dog (=1).
34
All serum samples were kept at room temperature for 2 hours to allow them to clot before centrifugation (30 min, 1000 g), then stored at -20°C until required for analysis. Salven et al.
(1997) reported that serum VEGF concentrations were unaffected by a freeze-thaw cycle.
Biochemical parameters were analyzed according to standardized procedures using an analyser (Konelab 20i; Fa. Thermo Fischer Scientific Inc., Dreieich, Germany) and commercial kits. Haematology parameters were measured using a CellDyn 3500 Analyzer (Fa. Abbott GmbH & Co KG, Wiesbaden, Germany).
Histopathological examinations were performed by a board-certified pathologist (European College of Veterinary Pathologists) using surgical biopsies fixed in 10% buffered formalin, and routinely embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin.
The best source for measuring VEGF was determined by preliminary analysis of serum and plasma from 10 healthy dogs and 38 dogs with different diseases. VEGF was not detectable in the serum or plasma of healthy dogs. VEGF was detected in the serum of 17 dogs with different diseases, but only in 2 plasma samples. Serum samples were therefore used in the current study.
4.1.3.2 VEGF assay
Serum VEGF levels were measured using a commercially available canine VEGF quantitative ELISA kit (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) following the manufacturer’s instructions.
In brief, 100 μl of assay diluent was added to each well of a microtitre plate, which had been coated with VEGF-specific monoclonal antibody, followed by the addition of 100 μl of standard or serum sample into each well. The microtitre plates were incubated for 2 hours at room temperature, followed by washing to remove unbound substances. Two hundred microliters of an enzyme-linked polyclonal antibody specific for VEGF were then added to the wells, followed by incubation for 2 hours at room temperature to bind to the immobilized VEGF.
The plates were washed a further three times. Two hundred microliters of substrate solution were then added to the wells and the colour developed in proportion to the amount of VEGF bound in the initial step. The preparation was incubated for 25 minutes at room temperature and was protected from light. Finally, 50 μl of a stop solution was added and the intensity of the colour was measured.
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Samples were analyzed using a TECAN microplate reader (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Austria) at an optical density of 450 nm and a wavelength correction of 570 nm.
Calibration was performed using a standard series of dilutions of recombinant canine VEGF.
Each standard and sample was conducted in triplicate and the mean values were calculated.
The average optical density value of the zero standard was then subtracted and the optical density of the standard solutions was plotted against their corresponding concentrations to generate a standard curve for the determination of VEGF concentrations for all samples.
According to the manufacturer’s instructions, the assay measures the predominant isoform VEGF164, and the minimum detectable dose of VEGF was defined as typically less than
According to the manufacturer’s instructions, the assay measures the predominant isoform VEGF164, and the minimum detectable dose of VEGF was defined as typically less than