Pathologisch-anatomische Begutachtung des Lymph-Knotens

Abbildung 4.13 zeigt die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen des Lymphknotens der Patientin. Zur Übersicht wurden eine Giemsa-, HE- und PAS-Färbung durchgeführt. Die anschließende mikroskopische Analyse ließ regressiv nekrobiotische Veränderungen im untersuchten Material erkennen. Das Material zeigte außerdem atypische Populationen mit hyperchromatischen, pleomorphen Zellkernen, die oft gekantet waren. Des Weiteren waren zahlreiche Mitosen zu beobachten. Weitere immunhistochemische Zusatzuntersuchungen innerhalb des atypisch proliferierenden Infiltrates ergaben eine positive Reaktion für CD79a, PAX5, Bcl-2 und MUM1. CD79a ist ein Marker für B-Zellen und PAX5 und Bcl-2 werden für den Nachweis von Lymphomen verwendet. Das multiple Myelom-Onkogen 1 wird als Marker für lymphoide Neoplasmen (u.a. diffuse B-Zell Lymphome) eingesetzt. Der Tumor-Marker CD30 zeigte einzelne positive Zellen, während EBV zahlreiche positive Zellen zeigte. Die Proliferationsrate wurde mittels Ki67 nachgewiesen und betrug teilweise bis zu 100%. Da Rituximab ein Antikörper ist, der sich gegen CD20 positive B-Zellen richtet, war die immunhistochemische negative Reaktion auf CD20 von bedeutender therapeutischer Relevanz. Des Weiteren war das Infiltrat negativ für den T-Zellmarker CD3, den Stammzell-Marker CD34 und das common ALL-Antigen CD10, das ein Marker für prä-B-ALLs ist. Die abschließende Beurteilung des Pathologen beschrieb eine monomorphe posttransplantations-lymphoproliferative Erkrankung (PTLD) mit Nachweis von EBV unter dem morphologischen Bild eines diffus großzelligen B-NHLs mit landkartenartigen regressiv-nekrobiotischen Begleitveränderungen.

Abb. 4.13: Immunhistochemische Färbungen des Lymphknotens. 71 Tage nach HSZT wurde eine Biopsie des Lymphknotens der Patientin vorgenommen. Die Analysen zeigten einen positiven Nachweis für EBV, Ki67 (Proliferationsrate bis zu 100%), PAX5, Bcl-2, CD79a und MUM1. Von bedeutender therapeutischer Relevanz war der negative Nachweis von CD20. Die Biopsie zeigte weiter atypische Populationen mit hyperchromatischen, pleomorphen Zellkernen und Mitosen. Die Aufnahmen wurden mit 10- bzw. 40-facher Vergrößerung aufgenommen.

5 Diskussion

5.1 Generierung EBV-spezifischer CIK-Zellen

Die Generierung von Zytokin-induzierten Killerzellen wurde erstmals 1991 von Schmidt-Wolf et al. beschrieben. Die Herstellung erfolgte aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (mononuclear cells, MNC) unter der Verwendung von IFN-γ, monoklonalem anti-CD3 Antikörper und IL-2 [68]. In einer früheren Arbeit von Grimm et al. wurde gezeigt, dass die Stimulation von human Lymphozyten mit IL-2 in der Generierung zytotoxischer Zellen resultierte, die eine Vielzahl an Tumor Zelllinien und auch frische autologe Tumore lysieren können. Diese Zellen wurden als Lymphokine-aktivierte Killer-Zellen bezeichnet und waren in der Lage Tumorzellen zu lysieren, die refraktär für die NK-vermittelte Lyse gewesen sind [97]. Eine weitere Studie hatte gezeigt, dass zytotoxischen Zellen in der Anwesenheit des mononukleären anti-CD3 Antikörpers aus PBMCs expandiert werden können [98]. Durch die Zugabe von IFN-γ 24 Stunden vor der Stimulation mit IL-2 konnte das zytotoxische Potential der hergestellten Zellen im von Schmidt-Wolf et al. etablierten Protokoll weiter gesteigert werden. Die Kulturdauer betrug 21 Tage, da die maximalen Zellzahlen zwischen Tag 21 bis 28 erreicht wurden und die maximale Aktivität zwischen Tag 10 bis 28 stattfand [68]. Im Laufe der letzten Jahre konnte die Effektivität der CIK-Zellen von verschiedenen Arbeitsgruppen stetig verbessert werden. Durch die Verwendung von Zytokinen wie IL-1, IL-7, IL-12 und IL-15 konnte die T-Zellproliferation und die zytolytische Aktivität gesteigert, die CD8 und T-Helfertyp 1 (TH1) Effektorfunktion gefördert und ebenso die Kulturdauer verkürzt werden [69, 99–102]. Charakteristisch für die CIK-Zellen ist die Expansion und Proliferation einer CD3⁺CD56⁺ Population, die aus klassischen CD3⁺CD56^- T-Zellen hervorgeht. Die Zytotoxizität der CIK-Zellen gegen verschiedene maligne Zellen verläuft MHC-unabhängig, jedoch bleibt das TCR-vermittelte Potential vorhanden.

Diese Arbeit basiert auf der Modifikation des CIK-Zell Protokolls durch Rettinger et al.

aus dem Jahr 2012 [69]. Durch die Verwendung von IL-15 anstelle von IL-2 zur Expansion konnte die Expansionsphase auf 10 Tage verkürzt werden bei gleichzeitiger Steigerung des zytotoxischen Potentials und weiterhin niedriger Alloreaktivität. Weitere Grundlage bildet die 2015 erschienene Veröffentlichung, in der erstmals CIK-Zellen zusätzlich mit spezifischen Antigenen ko-stimuliert wurden, um so einen

anti-Arbeit wurde ein Ansatz zur Generierung von CIK-Zellen gegen Leukämie und Epstein-Barr Virus getestet. Die Generierung erfolgte nach dem von Rettinger et al. etablierten Protokoll aus PBMCs EBV-seropositiver Spender mit einer Kultivierungsphase von 15 Tagen. Stimuliert wurden die Zellen mit IFN-γ an Tag 0, gefolgt von IL-2 und anti-CD3 24 Stunden später. An Tag 4 und alle darauffolgenden 3-4 Tage erfolgte eine Stimulation mit IL-15. Da eine einfache Stimulation mit dem EBV Consensus Peptid Pool nicht ausreichte um die vorhandenen EBV-spezifischen Zellen zu aktivieren, erfolgte eine zweifache Peptid-Stimulation an Tag 0 und 2 der Kultur (Abb. 3.1). Da an Tag 0 der Kultur die anfänglich noch vorhandenen Monozyten und B-Zellen innerhalb der PBMCs als APCs fungieren und die T-Zellen durch die Präsentation der EBV-spezifischen Peptide aktiviert und spezifisch geprimt werden können und an Tag 2 der Kultur im von Rettinger et al.

etablierten Protokoll keine Stimulation vorgesehen ist, wurden diese Tage gewählt.

Durch die Verwendung des beschriebenen modifizierten Protokolls konnte die Ko-Expansion EBV-spezifischer CIK-Zellen innerhalb der CIK-Zellkultur gewährleistet und so eine dual-spezifische Gesamtpopulation generiert werden. Da EBV mehrere immundominante Epitope besitzt, wurde der EBV Consensus Peptid Pool zur Stimulation gewählt. Auf diese Weise war es möglich, dass die Stimulation bei fast allen getesteten Spendern zu einer Erhöhung der EBV-spezifischen Zellen führte. Im Mittel konnte eine 5- bis 6-fache Steigerung erzielt werden. Die maximale gemessene Frequenz an EBV-spezifischen Zellen bei einer Spender-Kultur betrug 8,4% (BMLF⁺CD3⁺CD8⁺). Da die Dextramere zur Detektion der EBV-spezifischen Zellen MHC-restringiert sind und nicht für jedes MHC ein Dextramer vorhanden gewesen ist, konnte sehr wahrscheinlich bei keinem der Spender die komplette Antwort auf die Stimulation nachgewiesen werden.

Keine Antwort auf die Stimulation bedeutet deswegen aber nicht, dass der Spender keine EBV-spezifischen Zellen besitzt, sondern auf ein anderes EBV Epitop geprimt wurde.

Trotz durchlaufener EBV-Infektion kann es aber dennoch möglich sein, dass der Spender keine EBV-reaktiven T-Zellen gebildet hat. Weiterhin spielen auch die CD4⁺ T-Zellen eine Rolle in der Antwort auf EBV-Infektionen [38]. MHC-Klasse-II Multimere sind mittlerweile erhältlich, jedoch dauert die Produktion im Vergleich zu Klasse-I Multimeren deutlich länger und ist teurer. Im Rahmen der Herstellung EBV-spezifischer CIK-Zellen unter GMP-Bedingungen wurde ein EBNA1-spezifisches (DRB1*04:01) MHC-Klasse-II Tetramer verwendet. Da jedoch kein Spender für die in vitro Versuche den HLA-Lokus DRB1*04:01 besaß, konnten CD4⁺ T-Zellen in den in vitro Analysen nicht analysiert

werden. Vorwegzunehmen ist, dass die Frequenz an EBV-spezifischen CD4⁺ Zellen im GMP-Ansatz durch die Stimulation mit dem EBV Peptid Pool deutlich gesteigert werden konnte. Dazu wird in der Literatur beschrieben, dass EBV-spezifische CD4⁺ T-Zellen wichtig für die Entwicklung und Aufrechterhaltung des immunologischen Gedächtnisses sind [30]. Es ist davon auszugehen, dass sie auch bei den getesteten Spendern für die Versuche im Labormaßstab durch die Stimulation mit dem EBV Peptid Pool selektiv aktiviert wurden. Die Untersuchung dieser Immunantwort wäre für nachfolgende Arbeiten von großem Interesse. Zu erwähnen ist noch, dass die Frequenz an EBV-spezifischen Zellen in konventionell hergestellten CIK-Zellen ohne die zusätzliche Stimulation mit EBV Peptid gleich blieb.

Die Proliferationskapazität der CIK-Zellen insgesamt wurde durch die zusätzliche EBV Stimulation nicht beeinträchtigt. Im direkten Vergleich war die Proliferationsrate der EBV_Cons CIK-Zellen an Tag 15 der Kultur mit 93,7 gegenüber der der konventionellen CIK-Zellen (Rate: 78,5) sogar erhöht (n=12).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit PBMCs von EBV-seropositiven Spendern die Expansion EBV-spezifischer CIK-Zellen innerhalb der CIK-Zellkultur ohne Manipulation (z.B. Selektion der spezifischen Zellen) und mit geringem Zeitaufwand möglich ist. Die Verwendung des EBV Consensus Peptid Pools induziert dabei eine Stimulation mannigfacher EBV Epitope.

5.2 Der immunologische Phänotyp EBV-spezifischer