Generierung EBV-spezifischer Zytokin-induzierter Killer-Zellen

Generierung EBV-spezifischer Zytokin-induzierter Killer-Zellen

zur Behandlung

eines EBV-assoziierten malignen Lymphoms

DISSERTATION

Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität

in Frankfurt am Main

von

Lisa-Marie Pfeffermann aus Schweinfurt

Frankfurt 2018 (D30)

Vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der

Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.

Dekan: Prof. Dr. Clemens Glaubitz

Erster Gutachter: Prof. Dr. Rolf Marschalek Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Peter Bader Datum der Disputation:

Labor omnia vincit improbus.

Vergil

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 13

1.1 Leukämien im Kindesalter ... 13

1.1.1 Maligne Lymphome ... 14

1.2 Stammzelltransplantation ... 16

1.2.1 Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ... 17

1.2.2 Haploidente Stammzelltransplantation... 18

1.2.3 Transplantatbezogene Spender-Empfänger Reaktionen ... 19

1.2.4 Chimärismus und minimale Resterkrankung (MRD) ... 21

1.2.5 Immunrekonstitution und Risikofaktoren nach allogener SZT ... 22

1.3 Die Familie der Herpesviren ... 25

1.3.1 Epstein-Barr-Virus ... 26

1.3.2 EBV Infektion nach SZT und Therapie-Möglichkeiten ... 29

1.4 Immuntherapien ... 31

1.5 Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen ... 35

1.5.1 Phänotypische Charakterisierung und Effektormechanismen von CIK-Zellen .... 35

1.5.2 CIK-Zellen in der klinischen Anwendung/Studien ... 39

2 Zielsetzung 42 3 Spender, Material und Methoden 44

3.2 Material ... 45

3.2.1 Geräte und Software ... 45

3.2.2 Verbrauchsmaterialien... 46

3.2.3 Chemikalien, Medien, Puffer, Zusätze und GMP Materialien ... 46

3.2.4 Antikörper und Dextramere... 47

3.2.5 LEGENDplex™ Panels ... 49

3.2.6 Zellkulturen ... 50

3.3 Methoden Labormaßstab ... 51

3.3.1 Generierung primärer humaner CIK-Zellen ... 51

3.3.2 Kultivierung humaner Tumorzelllinien ... 53

3.3.3 Durchflusszytometrie ... 54

3.3.4 Zytotoxizitäts-Analysen ... 60

3.3.5 Zytokin- und Chemokin-Analysen ... 63

3.3.6 Statistik ... 64

3.4 GMP Scale-up ... 65

3.4.1 Patienten Charakteristik ... 65

3.4.2 Expansion EBV-spezifischer CIK-Zellen im klinischen Maßstab ... 65

3.4.3 Phänotypisierung der GMP-konformen EBV-spezifischen CIK-Zellen ... 66

3.4.4 Detektion der EBV-spezifischen Zellen ... 67

3.4.5 Zytokin- und Chemokin-Analysen ... 67

3.4.6 Monitoring des Immunstatus nach Transplantation ... 68

3.4.7 Zytotoxizitäts-Analysen ... 68

3.4.8 Pathologische Befundung des Lymph-Knotens ... 68

4 Ergebnisse 70

4.1.1 Vergleich der Expansion konventioneller CIK- und EBVCons CIK-Zellen ... 70

4.1.2 Expansion EBV-spezifischer Zellen ... 71

4.2 Immunphänotypisierung konventioneller CIK- und EBV_Cons CIK-Zellen ... 73

4.2.1 Vergleich der Subpopulationen konventioneller CIK- und EBVCons CIK-Zellen . 73 4.2.2 Vergleich des Gedächtnis-Phänotyps konventioneller CIK- und EBV_Cons CIK- Zellen ... 77

4.2.3 Expression von NKG2D auf EBV-positiven und EBV-negativen konventionellen CIK- und EBVCons CIK-Zellen ... 77

4.3 Funktionalitätsanalysen konventioneller CIK- und EBV_Cons CIK-Zellen ... 79

4.3.1 Zytotoxische Aktivität gegen EBV Consensus peptidbeladene BJAB-Zellen ... 79

4.3.2 Zytotoxische Aktivität gegen AML Zellen ... 80

4.4 Profil der Zytokin- und Chemokinsekretion konventioneller CIK- und EBVCons CIK-Zellen ... 82

4.5 GMP Scale-up ... 85

4.5.1 Expansion der EBV-stimulierten CIK-Zellen unter GMP-Bedingungen ... 85

4.5.2 Klinisches Ansprechen auf die Gabe EBV-stimulierter CIK-Zellen ... 86

4.5.3 Detektion der EBV-spezifischen Zellen und Immun-Monitoring ... 88

4.5.4 Profil der Zytokin- und Chemokin-Sekretion im peripheren Blut der Patientin ... 90

4.5.5 In vitro Zytotoxizität der GMP-konformen EBV-spezifischen CIK-Zellen ... 91

4.5.6 Pathologisch-anatomische Begutachtung des Lymph-Knotens ... 92

5 Diskussion 94

5.2 Der immunologische Phänotyp EBV-spezifischer CIK-Zellen ... 97

5.3 Bewertung der dualen Effektivität EBV-spezifischer CIK-Zellen ... 101

5.3.1 Zytotoxizität gegen EBV-Zielzellen ... 101

5.3.2 Erhaltung des anti-Tumor Potentials ... 102

5.4 Die Zytokin-/Chemokin-Sekretion EBV-spezifischer CIK-Zellen ... 105

5.5 Klinische Anwendung ... 107

6 Zusammenfassung 114

7 Literatur 117

A Abbildungsverzeichnis I

B Tabellenverzeichnis III

C Abkürzungsverzeichnis IV

D CD-Nomenklatur VII

E Zytokine und Chemokine IX

F Danksagung X

G Eigene Publikationsliste XII

H Lebenslauf XIII

I Eidesstattliche Erklärung XIV

1 Einleitung

1.1 Leukämien im Kindesalter

Unter Leukämien versteht man bösartige Erkrankungen des blutbildenden Systems, die im Ort der Blutbildung, dem Knochenmark entstehen. Mit etwa 600 Neuerkrankungen im Jahr und einem Anteil von 31% sind Leukämien die häufigsten Krebserkrankungen im Kindes- und Jugendalter in Deutschland. Im Allgemeinen gehen sie mit einer Störung im Reifungsprozess der weißen Blutzellen (Leukozyten) einher. Man unterteilt die Leukämien in zwei Gruppen: lymphoblastische und myeloische Leukämien. Sie können entweder akut oder chronisch verlaufen, wobei im Kindes- und Jugendalter über 95% akut verlaufen. Mit 80% ist die akute lymphatische Leukämie (ALL) die häufigste Form der Leukämie im Kindes- und Jugendalter [1]. Die Ursache der ALL liegt in der malignen klonalen Vermehrung unreifer Vorläuferzellen, den Lymphoblasten. Die Entartung kann auf verschiedenen Stufen der Lymphozyten-Entwicklung stattfinden. Je nach Ursprung der Lymphoblasten unterscheidet man zwischen B-Vorläufer ALL (Inzidenz 84%; B-ALL 3%) und T-ALL (Inzidenz 13%). Durch standardisierte Behandlungsformen liegt die dauerhafte Heilungsrate bei fast 90%. Die Wahrscheinlichkeit der akuten myeloischen Leukämie (AML) liegt bei 15-20%. Sie ist die zweithäufigste Form hat aber im Vergleich zur ALL eine schlechtere Prognose. Die AML entsteht durch einen Defekt in der Bildung früher myeloischer Vorläuferzellen. Diese reifen nicht mehr zu funktionstüchtigen Zellen heran, sondern entarten und proliferieren schnell und unkontrolliert. Auf diese Weise wird die normale Blutbildung verdrängt und gesunde Leukozyten sowie rote Blutkörperchen (Erythrozyten) und Blutplättchen (Thrombozyten) werden nicht mehr in ausreichender Menge gebildet. Durch verbesserte Behandlungsmaßnahmen liegt die Heilungsrate mittlerweile aber bei über 70%. Da sowohl die ALL als auch die AML das gesamte Organsystem befallen können, werden sie als bösartige Systemerkrankungen bezeichnet.

Blutarmut (Anämie), Infektionen und Blutungsneigung können erste Anzeichen einer Leukämie sein [1].

Eine weitere, bei Kindern aber eher seltene Form der neo- oder dysplastischen Knochenmarkserkrankungen ist das myelodysplastische Syndrom (MDS). Der Auslöser dieses Syndroms ist in den meisten Fällen nicht bekannt aber bei einem kleinen Teil auf die Strahlen- oder Chemotherapie einer vorherigen malignen Erkrankung zurückzuführen.

Unter diesen Umständen spricht man von einem sekundären MDS. Die Ursachen des MDS

lassen sich z.T. auf einen Defekt in der Hämatopoese durch genetisch veränderte Stammzellen zurückführen. Dadurch kommt es zu Differenzierungs- und Reifungsstörungen in der Entwicklung der Hämatopoese und infolge dessen zu verminderten Zellzahlen im Blut. Die Therapie der Wahl ist die allogene Stammzelltransplantation. Die Heilungsrate liegt hiermit bei etwa 70-85% [2, 3].

Mit Hilfe unterschiedlicher Systematiken können die akuten Leukämien in verschiedene Subtypen eingeteilt werden. Die World Health Organization (WHO)–Klassifikation stützt sich dabei auf morphologische, zytogenetische und molekulargenetische Merkmale, wohingegen die French-American-British (FAB)–Klassifikation auf morphologischen und zytochemischen Eigenschaften beruht. In der Regel werden die akuten Leukämien entsprechend der moderneren WHO-Klassifikation eingeteilt. Die Behandlung erfolgt klassifikationskonform nach internationalen Therapieprotokollen im Rahmen von Therapieoptimierungsstudien und lässt sich in vier Therapiephasen einteilen: Am Anfang steht eine intensive Induktionstherapie, gefolgt von einer Konsolidierungs- und Reinduktionstherapie. Den Abschluss bildet eine Erhaltungs- und Dauertherapie, die bis zu zwei Jahre betragen kann [4]. Bei Nicht-Ansprechen der Therapie und Rezidiv-Bildung, sowie bei Hochrisikopatienten stellt die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) eine weitere Therapieoption dar.

1.1.1 Maligne Lymphome

Die dritthäufigste Krebserkrankung ist mit einem Anteil von 11% (ca. 210 Neuerkrankungen pro Jahr) das maligne Lymphom [1]. Dieses geht von Zellen des lymphatischen Systems aus, die bösartig verändert sind. Man unterteilt die malignen Lymphome in zwei Hauptgruppen: Die Hodgkin-Lymphome (Morbus Hodgkin) und die Non-Hodgkin-Lymphome (NHL). Die Unterscheidung ist nur durch eine histologische Untersuchung des befallenen Gewebes möglich. Morbus Hodgkin entsteht durch bösartige Veränderungen der B-Lymphozyten und tritt überall im Körper auf, wo sich lymphatisches Gewebe befindet. Dabei sind die Lymphknoten am häufigsten betroffen. Mikroskopisch lassen sich im befallenen Gewebe so genannte Reed-Sternberg-Riesenzellen oder Hodgkin-Zellen nachweisen, die beim NHL nicht vorkommen.

In Deutschland gibt es ca. 110 Neuerkrankungen von Non-Hodgkin-Lymphomen pro Jahr.

entstehen. Die B-NHL und die T-NHL gehen von reifen B- bzw. T-Lymphozyten aus, wohingegen die lymphoblastischen Lymphome durch die Entartung unreifer Lymphozyten (den Lymphoblasten) entstehen. Am häufigsten betroffen sind auch hier die Lymphknoten.

Da sich die NHL über das lymphatische Gewebe schnell im ganzen Körper ausbreiten können, sind fast alle NHL im Kindes- und Jugendalter hochmalig. Langfristige immunsuppressive Therapien können die Entstehung von NHL begünstigen [1]. Die Häufigkeitsverteilung der verschiedenen Krebserkrankungen ist in Abbildung 1.1 dargestellt.

Abb. 1.1: Häufigkeitsverteilung der verschiedenen Krebserkrankungen. Mit 30,9% sind Leukämien die häufigsten malignen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter gefolgt von primären Tumoren des ZNS mit 23,7% und den Lymphomen mit 14,1%. Seltenere Krebserkrankungen sind mit jeweils 4-6% die peripheren Nervenzelltumore, Nierentumore, Knochentumore, Weichteilsarkome und Keimzelltumore (eigene Abbildung nach Daten aus dem deutschen Krebsregister 2015 [1]).

1.2 Stammzelltransplantation

Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) beschreibt die Übertragung von Blutstammzellen eines Spenders auf einen Empfänger. Ursprungsmaterial der Blutstammzellen kann das Knochenmark, der Blutkreislauf (Leukapherese) oder die Nabelschnur sein. Der Transplantation geht eine myeloablative (knochenmarksschädigende) oder dosisreduzierte Konditionierung des Patienten voraus, um dessen eigenes hämatopoetisches System und Immunsystem zu beseitigen. Die Konditionierung erfolgt mittels Hochdosischemotherapie in Kombination mit oder ohne Strahlentherapie und Lymphodepletion. Ziel der Konditionierung ist es u.a., eine Immunsuppression beim Empfänger zu induzieren, um eine Abstoßung des Transplantates zu verhindern und das Engraftment, d.h. das Anwachsen zu sichern. Durch die Induktion der Myeloablation soll außerdem Raum für das Engraftment geschaffen werden. Des Weiteren soll durch den anti-tumorösen Effekt der Konditionierung die ursächliche hämatologische Erkrankung beseitigt bzw. reduziert werden [5, 6]. Für die Hochdosischemotherapie werden zudem Zytostatika eingesetzt, die sonst nicht in der Krebsbehandlung zum Einsatz kommen. Häufig verwendete Substanzen sind Cyclophosphamid, Etoposid, Fludarabin, Melphalan, Busulfan, Thiotepa und Treosulfan.

Um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden, werden in manchen Fällen auch Antikörper (AK) wie Anti-Thymozyten-Globulin (ATG) und Campath gegen potentiell verbliebene Immunzellen des Empfängers eingesetzt. Entscheidend für die Wahl des Konditionierungsregimes ist die Art der Grunderkrankung. Ziel der hämatopoetischen SZT ist es, durch den Transfer von Spender-Stammzellen beim Empfänger möglichst schnell ein komplettes und anhaltendes lymphohämatopoetisches System zu etablieren [6].

Nach Art des Spenders unterscheidet man dabei zwischen der autologen (auto, griechisch selbst) und der allogenen (allo, griechisch fremd) HSZT. Bei der autologen Form werden dem Patienten nach intensiver Radio-/ Chemotherapie eigene Blutstammzellen infundiert, die ihm vorher entnommen wurden. Diese Art der Transplantation setzt voraus, dass die eigenen Stammzellen möglichst tumorfrei und funktionstüchtig sind und sie ermöglicht eine zügige Rekonstitution des Immunsystems. Nachteilig ist, dass durch die Gabe der eigenen Zellen (im Vergleich zur allogenen HSZT) der antitumoröse bzw. antileukämische Effekt nicht vorhanden ist. Dieses Verfahren wird daher vor allem bei soliden Tumoren in der Hochrisikogruppe eingesetzt. Die Arbeit befasst sich im Folgenden ausschließlich mit

eines gesunden kompatiblen Spenders dem Empfänger infundiert. Durch die Übertragung fremder Stammzellen, werden die malignen Zellen des Empfängers als fremd erkannt und können somit zerstört werden [1, 7]. Die allogene HSZT ist mittlerweile eine Therapieoption für verschiedene maligne hämatologische und nicht-hämatologische Erkrankungen. Insbesondere Leukämien aber auch myelodysplastische Syndrome, Anämien, schwere Immunerkrankungen und angeborene Stoffwechselerkrankungen werden mit dieser Art der Therapie behandelt. Im Jahr 2015 wurden 42.171 Transplantationen (41% allogene und 59% autologe HSZT) in 37.626 Patienten (Ersttransplantationen) in Europa an die European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) gemeldet. Im Vergleich zum Jahr 2014 ist das eine Steigerung von 3,3%. Davon wurden 4490 Patienten unter 18 Jahren in pädiatrischen Einheiten transplantiert (3338 allogene und 1152 autologe HSZT) [8].

1.2.1 Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation

Elementar für die Durchführbarkeit einer allogenen HSZT ist das Vorhandensein eines passenden Spenders. Die Kompatibilität des Spenders richtet sich nach bestimmten Gewebemerkmalen. Diese werden beim Menschen als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet, deren gencodierende Abschnitte auf Chromosom 6 liegen. Sie bilden den Haupthistonkompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC).

Strukturell lassen sich zwei ähnliche Klassen von HLA-Antigenen unterscheiden:

HLA-Klasse-I Antigene (HLA-A, -B und -Cw) setzen sich aus einer α-Kette und dem β2- Mikroglobulin zusammen. Bevorzugt binden hier Nonamere endogen gebildeter Proteine (z.B. Auto-Antigene und virale Proteine). Sie befinden sich auf allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten und werden von zytotoxischen CD8⁺ T-Zellen erkannt.

HLA-Klasse-II Antigene (HLA-DR, -DQ und -DP) werden aus einer wenig polymorphen α- und einer sehr polymorphen β-Kette gebildet. Das ermöglicht die Bindung von größeren Peptiden, die überwiegend von exogenen Proteinen stammen. Sie befinden sich auf professionell antigen-präsentierenden Zellen (antigen presenting cells, APC) und werden von den CD4⁺ T-Helferzellen erkannt [9].

Die HLA-Typisierung der Spender erfolgt molekulargenetisch mittels hochauflösender DNA-Sequenzierung. Für die Gewebeverträglichkeit von Spender und Empfänger ist eine Übereinstimmung der Merkmale HLA-A, -B, -C, -DR und -DQ von Relevanz. Das

Matching lässt sich aufgrund der Art des Spenders (Familien-/ Fremdspender) und der Anzahl der „Matches“ in drei Kategorien unterteilen.

MSD 10/10

MD 10/10 MFD

9-10/10 MUD

MMD ≤ 8/10 MMFD und MMUD

MSD=matched sibling donor, MD=matched donor, MFD=matched family donor, MUD=matched unrelated donor, MMD=mismatched donor (nach Peters et al. [10]).

1.2.2 Haploidente Stammzelltransplantation

Wird kein passender Familien- oder Fremd-Spender gefunden, stellt die haploidente SZT eine mittlerweile gut etablierte Therapieoption dar [11]. Haploident bedeutet, dass lediglich die Hälfte der HLA-Merkmale, also 5/10 übereinstimmen. In diesem speziellen Fall, der bei ca. 20% der Patienten zutrifft, wird über die HLA-Barriere hinweg transplantiert [6].

Als Stammzellspender dient meist ein Elternteil. Die hohe HLA-Disparität zwischen Spender und Empfänger stellt jedoch ein erhebliches Risiko für den Ausgang der Behandlung dar und ist mit großen Nebenwirkungen verbunden. Um die HLA-Barriere zu überwinden, wurde in präklinischen Studien das Konzept der Megadosen-Behandlung etabliert. Das bedeutet, es wird eine sehr große Anzahl an CD34⁺ Blutstammzellen transplantiert [12, 13]. Auf diese Weise wird versucht, ein sicheres Engraftment zu induzieren. Um gleichzeitig das Risiko einer Graft versus Host Disease (GvHD) zu vermindern und eine Abstoßung des Transplantats zu vermeiden, müssen alloreaktive Immunzellen des Spenders zuvor im Transplantat depletiert werden. Für die Depletion alloreaktiver T- und B-Zellen wird meist das immunomagnetische Verfahren der CD3/CD19-Depletion verwendet. Mittlerweile gibt es alternativ den Ansatz der TCRα/β- Depletion bei dem die Depletion über die T-Zell Rezeptoren (T cell receptor, TCR) erfolgt [14]. Durch eine nahezu vollständige Depletion der T-Zellen im Transplantat in Kombination mit einer intensiven Konditionierungsphase, kann die haploidente SZT zu einer verzögerten T-Zell Regeneration führen. Daraus resultiert ein hohes Infektionsrisiko und erhöhte transplantationsbedingte Mortalitäten (transplant related mortality, TRM).

Dies versucht man zu verhindern, indem verschiedene Zelltherapien kombiniert werden.

Durch die Kombination einer CD34-Selektion mit einer CD3/19-Depletion werden sowohl

immunologisch wirksame Zellen (wie residuale T-Zellen und Natürliche Killer (NK)- Zellen), die für eine schnellere Immunregeneration und zusätzlich für einen Graft versus Leukämie/Tumor (GvL/T)-Effekt sorgen können. Auch das Risiko einer post- lymphoproliferativen Erkrankung nach Transplantation (post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD) kann durch die kombinierte Therapie reduziert werden. Weiterhin wird durch eine dosisreduzierte Konditionierung (reduced intensity conditioning regime) versucht, die TRM-Rate zu reduzieren [15, 16].

1.2.3 Transplantatbezogene Spender-Empfänger Reaktionen Graft versus Leukämie/Tumor (GvL/T) Effekt

Die Hauptursache für ein Therapieversagen nach SZT ist das Rezidiv der Grunderkrankung. Retrospektive Analysen konnten zeigen, dass Patienten, die zur Prophylaxe einer GvHD ein T-Zell depletiertes Transplantat erhalten hatten oder auch die haploident transplantiert wurden, ein erhöhtes Rezidivrisiko haben. Diese Analysen bestätigten die Existenz eines durch allogene T-Lymphozyten des Spenders vermittelten GvL/T Effektes [6, 17]. Alloreaktive T- und NK-Zellen des Spenders erkennen residuale Leukämie- oder Tumorzellen als fremd und zerstören diese. Limitierender Faktor ist das Risiko einer schweren GvHD durch die Gabe von Spender-Lymphozyten, da diese auch das gesunde Gewebe des Empfängers angreifen können. Um das zu vermeiden, wurde eine zeitlich versetzte Vorgehensweise entwickelt, bei der die Spender-Lymphozyten-Infusion (donor lymphocyte infusion, DLI) zeitlich von der Transplantation getrennt ist. Auf diese Weise kann nach T-Zell depletierter SZT ein GvL/T-Effekt erzielt und das Rezidivrisiko erheblich gesenkt werden [18]. Die Effektivität dieser Behandlung wurde weltweit von vielen Transplantationszentren bestätigt [19, 20]. Die diesem Effekt zugrundeliegenden Effektormechanismen sind jedoch nur unzureichend geklärt.

Graft versus Host Disease (GvHD)

Eine der lebensgefährlichsten Komplikationen nach allogener HSZT, die mit einer hohen Morbidität und Mortalität verbunden ist, ist die Entwicklung einer GvHD. Sie resultiert aus immunkompetenten residualen T-Lymphozyten des Spenders im Transplantat, die die HLA-Merkmale des Empfängers als fremd erkennen und diese angreifen. Tritt die GvHD

innerhalb von 100 Tagen nach SZT auf, spricht man von einer akuten GvHD (aGvHD).

Die chronische GvHD (cGvHD) manifestiert sich ab 100 Tage nach SZT und ihr geht meist eine aGvHD voraus. Übergänge sind unter Umständen fließend und so, dass bei der Einordnung häufig eher das klinische Erscheinungsbild als das zeitliche Auftreten nach allogener HSZT eine Rolle spielt. Betroffene Organe sind meist die Haut, der Darm, die Leber und selten auch die Lunge [6]. Die Einteilung der GvHD erfolgt nach der von Glucksberg 1974 festgelegten Gradeinteilung. Dabei wird aus dem Ausmaß der Schädigung einzelner Organe ein Organstadium definiert (Schweregrad 1-4) und aus der Kombination aller betroffenen Organe der Gesamtschweregrad der GvHD (Grad I-IV) festgelegt (Tab. 1.1) [21]. Eine schwere akute oder chronische GvHD Grad II-IV kann lebensbedrohlich für den Patienten sein.

Tab. 1.1: Gesamt-Grad der akuten GvHD nach Glucksberg.

Grad Haut Darm Leber Einschränkung des

Allgemeinzustandes

I (leicht) 1-2 0 0 keine

II (mäßig) 1-3 1 1 leicht

III (schwer) 2-3 2-3 2-3 mäßig

IV (lebensbedrohlich) 2-4 2-4 2-4 deutlich

Die Ziffern 0-4 definieren den Schweregrad der Organschädigung (Tabelle aus Kröger et al. [6]).

Die Wahrscheinlichkeit einer akuten Grad II-IV GvHD beträgt bei HLA-identischen Familienspendern 25-60% und bei unverwandten Spendern sogar bis zu 70%. Um das Risiko einer GvHD zu verringern, sind die folgenden drei Elemente von Bedeutung:

Spender-Empfänger-Faktoren, die pharmakologische Immunsuppression und die T-Zell Depletion des Grafts. Risikofaktoren zwischen Spender und Empfänger sind die HLA- Disparität, die Stammzellquelle, Alter, Transfusionen und Schwangerschaften des Spenders, sowie Geschlechtsunterschiede zwischen Spender und Empfänger. Die pharmakologische Immunsuppression wird eingesetzt, um das Risiko einer GvHD zu verringern. Dazu werden dem Patienten prophylaktisch Immunsuppressiva verabreicht. Im Zuge der Konditionierungsphase wird bspw. gegen Ende Cyclosporin A (CSA) in

Zusätzlich kann während der Konditionierungsphase eine Antikörpertherapie mit ATG oder Campath erfolgen. Diese Antikörper können persistieren und somit auch noch nach SZT wirksam sein. Die Ersttherapie bei akuter und chronischer GvHD besteht in der Gabe von Kortison (Methylprednisolon und/oder MMF). Ist die GvHD jedoch steroidrefraktär kann eine erneute Behandlung mit ATG erfolgen und es bestehen weitere Therapiemöglichkeiten wie die Gabe von Pentostatin, Sirolimus, monoklonalen Antikörpern, oder auch mesenchymalen Stromazellen und die extrakorporalen Photopherese (ECP) [6, 7]. Die Depletion der T-Zellen im Transplantat kann physikalisch (z.B. durch ECP) oder immunbiologisch (z.B. durch monoklonale Antikörper) erfolgen.

Host versus Graft Reaktion (HvG)

Die HvG Reaktion, auch bezeichnet als Graft failure, beschreibt die Abstoßung des Transplantats durch den Empfänger. Verantwortlich dafür sind residuale T-Lymphozyten des Empfängers, die die Konditionierungsphase überlebt haben und die transplantierten Stammzellen des Spenders als fremd erkennen und bekämpfen. Abstoßungsreaktionen finden meist in den ersten 50 Tagen nach SZT statt. Dabei wachsen die Stammzellen entweder erst gar nicht an (Non-Engraftment) oder es kommt nach einer kurzen Regenerationsphase zu einer Abstoßungsreaktion. Bei HLA-different transplantierten Patienten ist die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßungsreaktion viel höher (20-30%) als bei HLA-ident transplantierten (ca. 2%). Haploident transplantierte Patienten bergen das größte Risiko, da zum einen nur die Hälfte der HLA-Merkmale übereinstimmen und zum anderen die Transplantate T-Zell depletiert sind und somit die zytotoxischen T-Zellen des Spenders fehlen, die residuale T-Lymphozyten des Empfängers bekämpfen können [6, 22].

Zu wenig Stammzellen im Transplantat und die GvHD-Prophylaxe sind weitere Risikofaktoren. Um eine Abstoßungsreaktion frühzeitig zu erkennen, werden nach SZT Chimärismus-Analysen von Blut und Knochenmark durchgeführt. Die Gabe einer DLI und die Minderung der GvHD-Prophylaxe können einem steigend gemischten Chimärismus entgegenwirken und somit eine Abstoßungsreaktion verhindern.

1.2.4 Chimärismus und minimale Resterkrankung (MRD)

Der Begriff des Chimärismus beschreibt die Koexistenz von Geweben, die einen genetisch unterschiedlichen Ursprung haben. Die Besonderheit der SZT ist, dass nach

Transplantation das hämatopoetische System des Empfängers durch die Zellen des Spenders ersetzt wird und somit ein echter hämatopoetischer Spender-Chimärismus entsteht. Nach Transplantation entwickelt sich u.U. zunächst ein temporär gemischter Chimärismus (mixed chimerism, MC), der durch die Koexistenz von Spender- und Empfänger Hämatopoese definiert ist. Nach erfolgreicher Rekonstruktion der Hämatopoese durch ausschließlich Spenderzellen spricht man von einem vollständigen Chimärismus (complete chimerism, CC). Die Bestimmung des Chimärismus erfolgt aus peripherem Blut oder dem Knochenmark und wird standardmäßig mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) bestimmt. Unmittelbar nach SZT liefert der Chimärismus Informationen über das Engraftment der Zellen und ist außerdem in der späteren Phase in der Früherkennung eines Rezidivs sehr hilfreich [6, 23].

Unter der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) versteht man das Vorhandensein residueller Tumorzellen, die trotz intensiver Therapie im Körper verblieben sind. Für den Nachweis sind hochsensitive Verfahren von Nöten, deren Nachweisgrenzen weit jenseits der Auflösung des Lichtmikroskops liegen. Zu diesen Verfahren zählen die PCR, die Mehrfarb-Durchflusszytometrie (multicolour flow cytometry, MCFC) und ein neues Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung (next generation sequencing, NGS).

Auf diese Weise ist es möglich, weniger als eine maligne Zelle in einer Million gesunder Zellen zu identifizieren. Engmaschige MRD und Chimärismus-Analysen des Patienten nach SZT ermöglichen frühe Interventionsstrategien und tragen so zu einem verbesserten Therapieverlauf, einer frühen Risikoerkennung und einem verbesserten Langzeit-Verlauf bei und werden mittlerweile in vielen Transplantationszentren durchgeführt. Aktuelle Studien belegen, dass sich die Messung der minimalen Resterkrankung gut als prognostischer Marker und zur Rezidivfrüherkennung bei akuten Leukämien im Kindesalter eignet [24, 25].

1.2.5 Immunrekonstitution und Risikofaktoren nach allogener SZT

Die Zeit der Aplasie-Phase und auch die bis zur vollständigen Immunrekonstitution ist mit vielen Risikofaktoren verbunden. Daher ist es wichtig, den Immunstatus der Patienten vor allem im ersten Jahr nach Transplantation regelmäßig zu kontrollieren und zu überwachen.

Ca. 15-20 Tage nach SZT fangen die Zellen langsam an zu regenerieren und der Immunstatus wird zum ersten Mal überprüft. In den ersten drei Monaten nach SZT findet

die Überprüfung wöchentlich statt. Wie schnell die Immunrekonstitution einsetzt, hängt von verschiedenen Einflüssen ab. Relevante Faktoren, die sich positiv oder negativ auf die Immunrekonstitution auswirken können, sind die Art der Transplantation (autolog ↑ oder allogen ↓), die Stammzellquelle (Knochenmark ↓ oder PBSC ↑), der Anteil an T-Zellen im Transplantat (T-Zell Depletion bzw. CD34+ Selektion ↓), die HLA-Kompatibilität und die GvHD-Prophylaxe [26]. In der Regel dauert die Beendigung der Aplasie-Phase zwischen 12 und 21 Tagen. Nach Transplantation sind die ersten nachweisbaren Lymphozyten nach ca. 10-14 Tagen die NK-Zellen. Sie erreichen bereits im ersten Monat nach SZT wieder Normalwerte. Die Regeneration der T-Zellen ist abhängig von der Art der Transplantation und kann bei einer haploidenten HSZT bis zu 100 Tage dauern, obwohl das allgemeine Engraftment schneller ist. Bis die gesamten T-Lymphozyten wieder Normalwerte erreicht haben, kann es bis zu zwei Jahre und länger dauern. Die Immunrekonstitution der B-Zellen startet ca. 30-40 Tage nach SZT und hat nach 6-12 Monaten Normalwerte erreicht [6].

Durch die verzögerte Immunrekonstitution und vor allem in der Phase der Aplasie ist das Risiko für die Entwicklung einer lebensbedrohlichen bakteriellen, viralen, mykotischen oder protozoischen Infektion sehr hoch. Neben dem Rezidiv der Grunderkrankungen sind Virusinfektionen eine der häufigsten und schwerwiegendsten Komplikationen, die in 30%

der Fälle tödlich enden [27]. Am häufigsten sind de novo Infektionen oder Reaktivierungen von Epstein-Barr-Viren (EBV), Cytomegalieviren (CMV) und Adenoviren, da die Empfänger keine virusspezifischen T-Zellen besitzen, die diese Infektionen bekämpfen könnten. Die Inzidenz einer Virusinfektion ist bei T-Zell depletierten Transplantaten erhöht. Weiterhin wird dadurch die Entwicklung einer PTLD infolge einer EBV Infektion begünstigt. Die Gabe von ATG im Rahmen der Konditionierung erhöht das Risiko einer PTLD weiter [28]. Um das Risiko einer Virusinfektion zu vermindern, wird ab Tag +1 nach SZT mit einer intensiven Infektionsprophylaxe begonnen, zu der unter anderem die Gabe von Immunglobulinen zählt. Erste Hinweise auf eine Infektion werden mit Breitbandantibiotika und Virostatika behandelt.

Die Intensität der immunsuppressiven Therapie stellt eine große Schwierigkeit in der Phase der Immunrekonstitution dar. Folgende Faktoren müssen dabei berücksichtigt werden: Das Risiko einer GvHD soll vermindert aber gleichzeitig die Immunrekonstitution und somit das Risiko einer Virusinfektion nicht zu stark negativ beeinflusst werden. Zudem soll der

GvL/T Effekt erhalten bleiben und damit die Gefahr eines Rezidivs und einer Transplantatabstoßung vermindert werden (Abb. 1.2).

Abb. 1.2: Einfluss der immunsuppressiven Therapie. Durch eine starke Immunsuppression steigt das Risiko einer Infektion und der Transplantatabstoßung (HvG) bei gleichzeitig niedrigem GvHD Risiko. Der GvL/T Effekt wird jedoch ebenfalls vermindert und die Aplasie-Phase dauert länger an (eigene Abbildung).

1.3 Die Familie der Herpesviren

Die Familie der Herpesviren (Herpesviridae) umfasst mittlerweile mehr als 200 unterschiedliche Herpesviren. Davon sind jedoch lediglich 8 humanpathogen und werden als humane Herpesviren (HHV 1-8) bezeichnet [29]. Die Klassifikation erfolgt aufgrund ihrer Pathogenität, dem infizierenden Zelltyp und ihrer Vermehrungseigenschaften in die folgenden 3 Untergruppen: α-, β- und γ-Herpesviren. Zu den α-Herpesviren gehören der Herpes-simplex-Virus 1 und 2 und das Varizella-Zoster-Virus (HHV 3), das der Erreger der Windpocken (Varizellen) und der Gürtelrose (Zoster) ist. Charakteristisch für die Untergruppe ist ein relativ schneller Replikationszyklus (<24 Stunden), ein breites Wirtsspektrum und die vornehmliche Etablierung ihrer Latenz in den Neuronen. Zu den β- Herpesviren zählen das Cytomegalo-, Muromegalo- und Roseolovirus. Im Gegensatz zu den α-Herpesviren haben sie einen Replikationszyklus von mehreren Tagen, sind streng speziesgebunden und besitzen die Fähigkeit, befallene Zellen stark zu vergrößern (Zytomegalie). Beispielhaft dafür ist das Cytomegalievirus (HHV 5). HHV 5 ist das größte Virus innerhalb der Herpesviridae. Die Infektion verläuft meist asymptomatisch und breitet sich langsam im ganzen Körper aus. Bei immunsupprimierten Patienten kann dies zu schweren Infektionen mit tödlichem Ausgang führen. Zur Untergruppe der γ- Herpesviren gehören das Epstein-Barr-Virus (Abb. 1.3) und das Kaposi-Sarkom-Virus aus der Gattung der Lymphocrypto- bzw. Rhadinoviren. Das Epstein-Barr-Virus (HHV 4) infiziert vornehmlich B-Lymphozyten aber auch Epithelzellen des Oropharynx und ist der Erreger der infektiösen Mononukleose (Pfeiffersches Drüsenfieber). Eine Infektion kann, vor allem bei immunsupprimierten Patienten, zu proliferativen Syndromen führen und somit an der Entstehung maligner Erkrankungen, wie dem Burkitt- und Hodgkin- Lymphom, dem Nasopharynxkarzinom, dem transplantationsassoziierten B-Zell Lymphom, sowie dem B-lymphoproliferativen Syndrom beteiligt sein [30]. Vor allem die Entstehung post-lymphoproliferativer Erkrankungen nach Transplantation werden durch eine EBV Infektion begünstigt und können wie die Cytomegalievirus Infektion tödlich enden. Charakteristisch für alle Herpesviren ist ein doppelsträngiges DNA Genom und die Vermittlung von Latenz [29, 31]. Bei der latenten Infektion handelt es sich um eine persistierende Infektion, bei der das Virusgenom nach der Primärinfektion in der Wirtszelle verbleibt. In der latenten Phase findet keine Expression viraler Gene oder von Viruspartikeln statt. Jedoch kann die latente Phase durch endo- und exogene Einflüsse in

die lytische – virusproduzierende – Phase übergehen [29]. Diese Reaktivierung kann vor allem für immunsupprimierte Patienten nach SZT gefährlich werden.

Abb. 1.3: Virion des Epstein-Barr-Virus. Das EBV-Genom besteht aus einer doppelsträngigen (ds) DNA und ist umgeben von einem ikosaedrischen Capsidprotein. Dieses umgibt wiederum ein Tegument bestehend aus regulatorischen Proteinen, das von einer Hülle ummantelt wird. Diese enthält zahlreiche Hüllproteine (vornehmlich Glykoproteine) auf der Oberfläche [32] (Abbildung entnommen und verändert aus Microbewiki [33]).

1.3.1 Epstein-Barr-Virus

Das Epstein-Barr-Virus (EBV, HHV4) wurde zum ersten Mal 1964 in kultivierten B- Lymphozyten eines afrikanischen Burkitt Lymphoms entdeckt und beschrieben und wurde seit seiner Entdeckung in einer Reihe anderer Tumore gefunden [34]. Die weltweite Durchseuchungsrate liegt im Erwachsenenalter bei über 90%. In Deutschland sind Kinder im Alter von 2 Jahren bereits zu 50% infiziert und Erwachsene von über 40 Jahren zu über 99%. Die Übertragung erfolgt hauptsächlich oral durch Speichel aber auch in sexuellen Sekreten ist EBV nachweisbar. Weitere Übertragungswege sind über lymphozytenhaltige Blutprodukte und über Transplantate. Diese Wege spielen vor allem bei EBV- Primärinfektionen unter Immunsuppression eine wichtige Rolle [29]. Lediglich zwei Zelltypen können durch EBV infiziert werden: Epithelzellen des Oropharynx und B- Lymphozyten. Welcher der beiden initial infiziert wird, ist jedoch unklar. Es wird vermutet, dass das Virus in der frühen Phase der Primärinfektion die oralen Epithelzellen infiziert und sich dort repliziert, bevor es die B-Zellen infiziert [35]. Eine Primärinfektion im Kindesalter verläuft meist asymptomatisch oder ruft lediglich milde Symptome hervor.

Im Jugend- und Erwachsenenalter geht eine Primärinfektion jedoch in 75% der Fälle (bei den 18- bis 22-jährigen) mit einer infektiösen Mononukleose (IM), auch bekannt als Pfeiffersches Drüsenfieber, einher [32, 35, 36]. Diese präsentiert sich meist mit hohem

Fieber, Lymphadenopathie und Pharyngitis und hat einen Inkubationszeitraum von ca. 4-6 Wochen [36, 37].

Immunantwort nach EBV Infektion

Bei einer initialen EBV-Infektion über den Speichel, werden zunächst die Schleimhautepithelzellen des Speichels infiziert. Die dort replizierten Viren exprimieren ein großes Spektrum an immediate early (IE), early (E) und late (L) Proteinen des lytischen Zyklus (Abb. 1.4). Infektiöse Replikate des Virus infizieren wiederrum naive B- Zellen in der oralen Mukosa und in lymphoiden Organen des Oropharynx. Die EBV- infizierten B-Zellen treten entweder in den lytischen oder den latenten Zyklus ein.

Infizierte B-Zellen im latenten Zyklus migrieren zurück in das lymphoide Gewebe. Das latente Stadium zeichnet sich durch die Expression viraler latenter Gene aus, wobei sich die Latenz je nach Expressionsprofil in verschiedene Stadien unterteilen lässt (Tab. 1.2).

Zu den latenten Proteinen zählen die 6 nuklearen Antigene EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen) 1, 2, 3A, 3B, 3C, und –LP und die 2 latenten Membran Proteine LMP (latent membrane protein) 1 und 2. Werden alle Gene exprimiert, wird dies als Latenz III bezeichnet. Die Expression der latenten Gene führt zur Präsentation antigener Zielstrukturen auf der infizierten Zelle, wodurch die humorale und zelluläre Immunantwort aktiviert wird [29, 38].

Abb. 1.4: Schematische Darstellung immundominanter EBV Proteine in gesunden Virus-Trägern.

Gezeigt sind repräsentative immediate early (IE), early (E) und late (L) Proteine der lytischen und latenten Zyklus-Proteine für die CD8⁺ und CD4⁺ T-Zell Antwort. Die gestrichelten Pfeile weisen darauf hin, dass eine CD4⁺ T-Zell Antwort beobachtet wurde aber ihre Immundominanz noch nicht bestimmt wurde. Nicht getestete Proteine sind mit n.t. (not tested) bezeichnet (Abbildung entnommen und verändert aus Hislop et al.

[32]).

Für die Kontrolle einer EBV-Infektion ist die zelluläre Immunantwort essentiell. Bei einer Primärinfektion sind zytotoxische CD8⁺ T-Zellen die wichtigste Zellpopulation, um die proliferierenden EBV-infizierten B-Zellen zu kontrollieren. Bei einer akuten Infektion kann der Epitop-spezifische CD8⁺ T-Zell Pool dramatisch expandieren (5-10-facher Anstieg) [38]. Die Antwort der zytotoxischen T-Zellen ist MHC-I restringiert. Indem die infizierten B-Zellen die Expression der latenten Gene unterdrücken (Latenz I/II) oder ganz einschränken (Latenz 0), können sie der T-Zell Antwort entgehen und so lebenslang im Wirt persistieren [32]. Die Ausbildung der Latenzstufe I oder 0 ist charakteristisch für EBV-infizierte Gedächtnis B-Zellen. Kommen diese Zellen wieder mit Antigen in Kontakt, kann das ihre Differenzierung in Plasmazellen induzieren und die lytische Phase von EBV einleiten [29]. Charakteristisch für eine akute Infektion sind hohe Viruslasten im Blut und den oralen Kavitäten. Diese gehen einher mit ungewöhnlich hohen Zahlen an zirkulierenden CD8⁺ zytotoxischen T-Zellen, die spezifisch für EBV Antigene der IE oder E Phase des lytischen Zyklus sind. Gleichzeitig erkennen CD4⁺ T-Helferzellen über ihren MHC-II Komplex weitere lytische Antigene. Sie unterstützen die T-Zell abhängige humorale Antwort und sind für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der CD8 vermittelten Immunantwort zuständig [38]. Des Weiteren werden bei einer akuten Infektion Immunglobulin (Ig)-M und IgG Antikörper gegen das virale Capsid Antigen (VCA) gebildet. Der Nachweis von VCA IgM kann jedoch auf Grund von CMV Infektionen zu einem falsch-positiven Ergebnis führen. Da alle IM Patienten IgG Antikörper gegen VCA bilden, ist dies der sichere Nachweis. IgG Antikörper gegen EBNA1, ein latentes Genprodukt, entwickeln sich frühestens 90 Tage nach einer primären Infektion aber persistieren dann ein Leben lang [39]. Die späte Bildung der EBNA1 Antikörper korreliert mit der verzögerten CD4⁺ T-Zell Antwort auf EBNA1 [38]. Liegt ein positiver Nachweis für IgG EBNA1 während einer akuten Infektion vor, handelt es sich nicht um eine primäre Infektion. [39]. Da die Eliminierung und auch eine Verhinderung der Reaktivierung nicht möglich sind, ist die Entwicklung einer adaptiven Immunantwort gegen latente Viren essentiell. Ist die Entwicklung der adaptiven Immunantwort auf humoraler oder zellulärer Ebene gestört oder wie bei z.B. immunsupprimierten Patienten geschwächt, führt dies zu einer unkontrollierten Expansion des Virus und kann tödlich enden.

Tab. 1.2: Expressionsprofile viraler Gene in latent infizierten B-Zellen.

1.3.2 EBV Infektion nach SZT und Therapie-Möglichkeiten

Nach allogener SZT stellen virale Infektionen vor allem in der frühen Phase ein lebensbedrohliches Risiko für die Patienten dar, da sie erst nach Ausbildung des vollen T- Zell Repertoires wieder ausreichend immunologisch geschützt sind. Dabei führen vor allem Infektionen mit EBV, AdV und CMV zu schwerwiegenden klinischen Komplikationen und sind oft mit Mortalität verbunden. Risikofaktoren stellen dabei die langanhaltende Immunsuppression, die verspätete T-Zell Recovery aufgrund der T-Zell Depletion des Graft oder des Einsatzes von ATG im Zuge des Konditionierungs-Regimes, die Behandlung oder Prophylaxe von GvHD, Empfänger/Spender HLA Disparitäten und Empfänger/Spender EBV-Mismatches dar [40]. Vor allem EBV seropositive Spender sind ein großes Risiko für EBV seronegative Empfänger. Das am häufigsten hervorgerufene klinische Symptom ist die zu mindestens 90% EBV-assoziierte PTLD [41]. In den meisten Fällen geht diese mit einer überschießenden EBV-gesteuerten Lymphozyten-Proliferation einher, die durch eine Reaktivierung oder durch eine Primär-Infektion, aufgrund der Abwesenheit von zytotoxischen T-Zellen, hervorgerufen werden kann [26, 42]. Die Form der PTLD variiert von gutartigen polyklonalen B-Zell Hyperplasien bis zu niedrig- und hoch-malignen monoklonalen B-Zell Lymphomen, die sich zu fulminanten Erkrankungen entwickeln können. Es wird angenommen, dass die EBV-assoziierte PTLD meistens vom Spender stammt. Sie zeichnet sich aus durch erhöhte Virus-Last im peripheren Blut, erhöhte Zahlen an EBV-infizierten mononukleären Zellen und spontanes Wachstum von EBV-transformierten B-Zellen ex vivo und in vivo [41, 43]. Charakteristisch für diese Virus-transformierten B-Zellen ist die Expression des Latenz III Stadiums [44]. In immunkompetenten Individuen erfolgt die klinische Diagnostik über Antigennachweise im Probenmaterial. Diese Nachweise basieren auf der Technik des Sandwich-ELISA oder der

Zelltyp Expressionsprofil virale Proteine

B-Zellen Latenz 0 ---

Latenz 1 EBNA1

Latenz 2 EBNA1, LMP1, LMP2A/B

Latenz 3 EBNA1, LMP1, LMP2A/B, EBNA1-LP, EBNA-2, EBNA2A/B/C

Tabelle nach W Doerr et al. [29].

Immunfluoreszenz. Nach Transplantation sind serologische Untersuchungen zum Nachweis einer EBV-Infektion jedoch gänzlich ungeeignet. Ein geeignetes Verfahren zum Monitoring der EBV-Last ist der Nukleinsäurenachweis viraler DNA mittels quantitativer PCR, da dieser sensitiver und spezifischer ist [26, 45]. Für die Behandlung einer EBV- Infektion nach SZT gibt es kein standardisiertes Therapie-Verfahren. Die verschiedenen Therapieformen reflektieren das große Spektrum an klinischen Erscheinungsbildern einer EBV-Infektion nach SZT. Oft werden verschiedene Therapieformen gleichzeitig angewandt. Die klassische Therapie der Wahl wäre die Reduktion der Immunsuppression.

Dies ist jedoch in der Frühphase nach SZT oft nicht möglich. Anti-virale Therapien, wie z.B. Aciclovir, sind meistens nicht effektiv, da sie zwar die Replikation der linearen EBV DNA inhibieren aber nicht die EBV Episome in latent infizierten Zellen angreifen [37, 46].

Eine mittlerweile gut etablierte Methode ist der Einsatz des monoklonalen Antikörpers Rituximab, der sich gegen CD20 positive B-Zellen richtet. Rituximab wird meist als Monotherapie eingesetzt mit einer wöchentlichen Gabe über einen Zeitraum von einem Monat und hält in der Regel für einige Monate an [47]. Da CD20 auf Lymphomzellen und B-Zellen exprimiert wird, nicht aber auf Stammzellen, ist der Wirkstoff vergleichsweise gut verträglich [48]. Die Effektivität von Rituximab zeigt sich vor allem in frühen Stadien der PTLD [37].

Neben der medikamentösen Behandlung stellt der Transfer adoptiver T-Zellen eine seit längerem etablierte Methode in Form einer zellulären Immuntherapie dar. Das können zum einen unselektierte Spender-Lymphozyten-Infusionen (donor lymphocyte infusion, DLI) sein und zum anderen der Transfer EBV-spezifischer zytotoxischer T-Zellen (cytotoxic T lymphocytes, CTL) [49]. Auf diese Weise wird versucht die antivirale Immunität nach SZT wiederherzustellen und dem Empfänger die immunologische Kontrolle über die Virus Replikation zu ermöglichen.

1.4 Immuntherapien

Unter dem Begriff Immuntherapie versteht man Behandlungsansätze, die die Aktivität des Immunsystems beeinflussen. Dabei unterscheidet man in der Hämatologie und Onkologie zwischen aktiven und passiven Ansätzen. Bei der aktiven Immunisierung wird versucht, das Immunsystem durch Vakzinierung oder die Gabe von körpereigenen Interferonen (IFN) oder Interleukinen (IL) (z.B. IFN-α und IL-2) zu stimulieren und somit das Immunsystem zur Bekämpfung von Tumorzellen zu aktivieren. Diese Therapieform wird zur Unterstützung des eigenen Immunsystems gegen Tumorzellen eingesetzt. Bei der passiven Immuntherapie handelt es sich um eine Substitution des Immunsystems durch die Gabe von Immunglobulinen, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind. Dabei handelt es sich um monoklonale Antikörper, die im Körper eine antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) induzieren und auf diese Weise die Lyse der Tumorzellen unterstützen [50]. In der Pädiatrie kommen verschiedene monoklonale Antikörper zum Einsatz. Rituximab z.B. (MabThera®) ist in Deutschland seit 1998 zugelassen und wird zur Behandlung von CD20-positiven B-NHLs eingesetzt. Durch die Bindung an CD20 auf B-Lymphozyten löst es über die ADCC die Apoptose der Tumorzellen aus. Alemtuzumab (Campath®) richtet sich gegen das CD52 Molekül auf reifen Lymphozyten und wird zur Konditionierung eingesetzt. Ein relativ neuer Ansatz ist das bispezifische T-Zell-Antikörperkonstrukt Blinatumomab (bispecific T cell engager, BiTE®), das sich gegen CD19 richtet und bei rezidivierenden oder refraktären B-Vorläufer ALL eingesetzt wird. Neben den tumorassoziierten Antigenen bindet Blinatumomab gleichzeitig polyklonale T-Zellen und verstärkt so die T-Zell vermittelte anti-Tumor Immunantwort [51].

Zelluläre Immuntherapie

In einer Veröffentlichung aus dem Jahr 1990 gelang es Kolb et al., den GvL-Effekt durch die alleinige Gabe von Spenderlymphozyten zur erfolgreichen Behandlung rezidivierender CML Patienten zu beweisen und somit das Feld der adoptiven zellulären Immuntherapien zu öffnen [52]. Die Idee der adoptiven Immuntherapien ist es, immunologische Effektorzelllen (hauptsächlich T-Lymphozyten aber auch NK-Zellen) ex vivo zu expandieren und/oder zu modulieren und sie dann zu verabreichen (Abb. 1.5). In vivo können die Zellen durch die Aktivierung einen GvL/T-Effekt ausüben und auch

expandieren, um so ein langfristiges immunologisches Gedächtnis zu entwickeln. Dabei gilt es aber zu beachten, dass die verabreichten Zellen zum einen eine GvHD auslösen und zum anderen auch gesundes Gewebe angreifen können. Mittlerweile ist die Gabe von DLIs als adoptive Immuntherapie eine gut etablierte Therapieoption [18, 19, 52, 53]. Eine weitere Form der DLI stellen virusspezifische T-Zellen dar, zu deren Selektion und Expansion mittlerweile eine Vielzahl an Methoden beschrieben wurde [54]. Die Stimulation der virusspezifischen T-Zellen erfolgt ex vivo durch die Ko-Inkubation von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) mit APCs, die zuvor mit viralen Plasmiden oder Vektoren transduziert wurden und entsprechende Antigene enthalten [55, 56]. Alternativ können PBMCs direkt mit Virus- Lysat oder –Peptiden inkubiert werden, um so die virusspezifischen Zellen zu stimulieren [57, 58]. Die Selektion kann durch die mittlerweile gut etablierte Methode der IFN-γ Sekretion erfolgen. Kommen virusspezifische T-Zellen mit viralen Partikeln in Kontakt, sekretieren sie IFN-γ und können aufgrund der Sekretion immunomagnetisch selektioniert werden [59]. Eine alternative Methode basiert auf der Multimer-Technologie. Dazu werden MHC-gekoppelte Antikörper verwendet, die Virus-Peptide präsentieren und zusätzlich an einen Fluoreszenz-Farbstoff gekoppelt sind. Das ermöglicht die Identifizierung der virusspezifischen T-Zellen. Die zusätzliche Kopplung an immunomagnetische beads ermöglicht anschließend eine direkte Selektion der virusspezifischen Zellen [60]. Die beschriebenen Verfahren haben alle Vor- und Nachteile und unterscheiden sich vor allem in der Dauer und den Kosten. In einer Studie von Heslop et al. konnte gezeigt werden, dass EBV-spezifische zytotoxische Spenderlymphozyten für mehrere Jahre im Patienten persistieren können und in der Lage sind, bei viraler Reaktivierung in vivo zu re- expandieren [61]. Zusätzlich wurden EBV-spezifische CTLs mit einem CD4- und CD8- positivem Phänotyp als Effektorzellen im antigen-spezifischen immunologischen Lang- Zeit Gedächtnis identifiziert. Durch die Gabe von virusspezifischen CTLs wurde ein immunologisches Gedächtnis generiert, dass für eine stetige Neubildung und somit ein besseres Überleben von Effektorzellen in vivo sorgt [61–64]. Sowohl die DLI als auch die virusspezifischen T-Zellen bieten durch ihre anti-Tumor Aktivität, ihre Proliferationsfähigkeit in vivo und ihre Persistenz eine zusätzliche und unterstützende Immunantwort.

Abb. 1.5: Adoptive Immuntherapie. Unter der adoptiven Immuntherapie versteht man die Übertragung von ex vivo modulierten oder aktivierten autologen und allogenen Spenderzellen, die nach Expansion dem Patienten infundiert werden (Abbildung entnommen und verändert aus Eggermont et al. [65]).

Eine neue Form der adoptiven Immuntherapie stellen die mittels chimärem Antigenrezeptor (chimeric antigen receptor, CAR) genetisch modifizierten T-Zellen dar, deren Anwendung in Amerika mittlerweile durch die U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassen ist (CTL019 CAR, Kymriah™). CAR T-Zellen sind rekombinante Rezeptor Konstrukte, die Antigene MHC-unabhängig erkennen können und trotzdem die ko-stimulatorischen Signale der T-Zellen beinhalten, wodurch sie eine starke zytotoxische Aktivität besitzen. Auf der Oberfläche der CAR T-Zellen befindet sich eine extrazelluläre Antigenbindungsregion, die über einen Spacer mit der Transmembran Domäne verbunden ist. Diese stellt eine Verbindung der extrazellulären Domäne mit der intrazellulären Ko- Stimulations- und Signal-Domäne her, welche von der intrazellulären CD3 ζ-Kette des TCR stammt [66, 67]. CAR T-Zellen kombinieren die Spezifität eines Antikörpers mit der Zytotoxizität und der Gedächtnis Eigenschaft der T-Zellen. Mittlerweile gibt es CAR T- Zellen der 3.Generation, welche neben der CD3 ζ-Domäne des TCR noch zwei weitere ko- stimulatorische Domänen besitzen. Diese führen zu einer verstärkten Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität (Abb. 1.6) [67]. Die Applikation der CAR T-Zellen im

Patienten kann jedoch mit starken Nebenwirkungen, wie z.B. dem Zytokin-Sturm (cytokine release syndrome, CRS) verbunden sein [66].

Abb. 1.6: Schematischer Aufbau der CAR T-Zellen. Charakteristisch für CAR T-Zellen ist das variable singel-chain Fragment (scFv), das von einem monoklonalen Antikörper abstammt und über einen Linker und die Transmembran Domäne (TM) mit dem Signalmotiv des TCR (CD3 ζ-Kette) verbunden ist. Durch die Addition weiterer ko-stimulatorischer aktivierender Domänen (Co-stim 1 in der 2.Generation und Co-stim 1 + Co-stim 2 in der 3.Generation), konnte die Proliferation, Zytotoxizität und Persistenz in vivo verstärkt werden (Abbildung entnommen und verändert aus Lee et al. [67]).

Die adoptive Immuntherapie mit Zytokin-induzierten-Killer (CIK)-Zellen stellt aufgrund der zytotoxischen und phänotypischen Eigenschaften der Zellen eine weitere innovative und mittlerweile etablierte Form der Therapie dar.

1.5 Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen

CIK-Zellen wurden das erste Mal 1991 von Schmidt-Wolf et al. im Jahr 1991 beschrieben und repräsentieren eine neue Immuntherapie, da sie aufgrund ihrer dualen Killing- Fähigkeit sowohl virusinfizierte als auch transformierte Zellen bekämpfen können [68].

CIK-Zellen sind eine heterogene, vorwiegend polyklonale Lymphozytenpopulation, die ex vivo aus mononukleären Zellen des peripheren Bluts, Knochenmarks oder der Nabelschnur durch die Zugabe der Zytokine IFN-γ, IL-2 und IL-15 sowie eines mononukleären anti- CD3 Antikörpers stimuliert und expandiert werden können. Durch die Verwendung von IL-15 an Stelle von IL-2 im Expansionsprotokoll, konnte die Kultivierungsphase von 21 auf 10 Tage verkürzt und das Zytotoxizitäts-Potential der CIK-Zellen erhöht werden [69].

Die expandierten CIK-Zellen bestehen größtenteils aus klassischen T-Zellen (TCR- αβ⁺CD3⁺CD56^-), doppelt positiven T-NK Zellen (CD3⁺CD56⁺), deren prozentualer Anteil während der Expansionsphase ansteigt und einer geringen Anzahl an NK-Zellen (CD3^- CD56⁺). T-NK Zellen erwerben im Laufe der Expansion das CD56 Molekül und stammen von Vorläufer T-Zellen ab [70]. CIK-Zellen haben ein hohes zytotoxisches Potential gegen diverse Erkrankungen und trotz des hohen Anteils an konventionellen T-Zellen zeigen sie nur eine geringe Alloreaktivität. Somit stellen sie sogar im haploidenten Transplantations- Setting nur ein geringes Risiko für die Induktion einer GvHD dar.

1.5.1 Phänotypische Charakterisierung und Effektormechanismen von CIK-Zellen

Phänotypisch lassen sich die CIK-Zellen größtenteils den T-Lymphozyten zuordnen, deren Charakteristikum das CD3 Molekül auf der Zelloberfläche ist. Es ist Bestandteil des membrangebundenen T-Zell Rezeptor Komplexes der T-Zellen. Der TCR ist für die Erkennung fremder Antigene zuständig, die auf der Oberfläche körpereigener Zellen präsentiert werden. Hinsichtlich der Struktur ähneln die TCRs stark dem Fab (fragment of antigen binding) -Fragment der Immunglobuline. Der TCR ist wie das Fab-Fragment ein durch Disulfidbrücken verbundener Heterodimer. Bei etwa 95% der T-Zellen besteht dieser Heterodimer aus einer α- und einer β-Polypeptidkette (αβ T-Zellen) und ist für die MHC-Peptid Erkennung zuständig. Die weiteren Heterodimere bestehen aus einer γ- und δ-Kette (γδ T-Zellen), die Peptide, Lipide und Kohlenhydrate erkennen. Beide Ketten sind jeweils in der Transmembran-Region verankert und durch die Disulfidbrücke zu einer

Struktur verbunden (Heterodimer). Jede Kette besteht aus einer konstanten (C) und einer variablen (V) Ig-Domäne. Die nebeneinanderliegenden variablen Domänen bilden wie im Fab-Fragment die Antigenbindungsstelle. Für die Aussendung eines Signals sind die 4 Signalübertragungsketten (zwei ε-, eine γ- und eine δ-Kette) des CD3-Komplexes zuständig, der zusammen mit einem Homodimer aus ζ-Ketten stark mit dem TCR assoziiert ist. Der CD3-Komplex hat regulatorische Funktionen und ist für die Expression des TCR an der Zelloberfläche und die Signaltransduktion nach Antigenkontakt zuständig.

Die Signalketten des CD3-Komplexes und die CD3 ζ-Kette enthalten spezifische Signalmotive, so genannte ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), die bei Liganden-Rezeptorbindung phosphoryliert werden und so die Signalübertragung in der Zelle in Gang setzen [71–73]. Die Antigenerkennung über den TCR ist MHC-restringiert.

Die Antigene werden den T-Zellen von vor allem APCs über ihren MHC auf der Zelloberfläche präsentiert und können so von den T-Zellen erkannt und gebunden werden.

Die Präsentation endogener Antigene, wie viraler Proteine, erfolgt über MHC-Moleküle der Klasse I, die von CD8⁺ T-Zellen gebunden werden. CD4⁺ T-Zellen sind MHC-II restringiert. Die Bindung des TCR an den Peptid-MHC-Komplex führt schließlich zur Aktivierung der T-Zelle.

Abb. 1.7: T-Zell Rezeptor Komplex. Der T-Zell Rezeptor Komplex setzt sich zusammen aus dem T-Zell Rezeptor (T cell receptor, TCR), der aus einem Heterodimer besteht (hier aus einer α- und einer β-Kette), den 4 Signalketten des CD3-Komplexes und dem CD3ζ-Homodimer. Die hypervariable Region des TCR ist in der Lage über MHC-Moleküle (hier MHC-Klasse-I) präsentierte Peptide zu erkennen und zu binden. Das führt zu einer Signalübertragung und resultiert in der Aktivierung der T-Zelle (Abbildung entnommen und übersetzt aus Juno Therapeutics [74]).

Ein weiteres Charakteristikum der CIK-Zellen ist, dass sie neben dem TCR einen weiteren Rezeptor, den aktivierenden NK-Zell Rezeptor NKG2D (natural killer group 2, member D) exprimieren. NKG2D ist ein transmembranes Homodimer der C-Typ-Lektin-Familie.

Zu den Liganden beim Menschen gehören die MHC-Klasse-I-ähnlichen MIC (MHC-class- I-related-chain-antigen) -Moleküle MIC-A und MIC-B sowie die UL16-Bindeproteine (unique-long-16-binding protein, ULBP). Die Expression der Liganden erfolgt als Reaktion auf zellulären oder metabolischen Stress, wie z.B. Virusinfektionen und bösartige Transformationen von Zellen. Durch die Expression von ULBP können die betroffenen Zellen den NKG2D Rezeptor auf T- und NK-Zellen aktivieren und so erkannt und eliminiert werden. Die NKG2D-Liganden Bindung löst einen programmierten Zelltod durch zytotoxische CD8⁺ T-Zellen aus. Die Lyse der Zielzellen wird durch die Exozytose zytotoxischer Granula der Effektorzellen vermittelt. Durch die Bildung einer Pore in die Plasmamembran der Zielzelle unterstützt Perforin die Freisetzung des Inhalts der Granula in das Zytosol der Zielzelle. Die Apoptose wird durch Granzyme (Granzym A und B), die als Serinproteasen wirken, im Zytosol der Zielzelle durch Caspase-abhängige und – unabhängige Signalwege ausgelöst. Auf diese Weise ist ein programmierter und zielgerichteter Zelltod möglich [75]. Weitere NK-Zell spezifische aktivierende Rezeptoren wie NKp30, NKp44, oder NKp46 und inhibierende Rezeptoren (KIR2DL1 und NKG2A) werden nur kaum oder gar nicht von CIK Zellen exprimiert [76, 77]. Typisch für die NK- Zell vermittelte Zytotoxizität ist außerdem die ADCC. Diese wird durch die Expression des Fc-Rezeptors für IgG-Antikörper, FcγRIII (CD16), vermittelt. Die Bindung des Rezeptors an eine Zielzelle resultiert in der Aktivierung der NK-Zellen, Ausschüttung zytotoxischer Granula und schließlich der Apoptose der Zielzelle [78]. Es wurde jedoch gezeigt, dass CD3⁺CD56⁺ CIK-Zellen keine signifikanten Level des CD16 Rezeptors exprimieren und somit das ADCC hauptsächlich durch den geringen Anteil an NK-Zellen in der CIK-Zell Population vermittelt wird [79].

Für die Bindung von CIK-Zellen an Tumorzellen sind weiterhin das Adhäsionsmolekül LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen 1, CD11a) und dessen Liganden ICAM 1- 3 (intercellular adhesion molecule), die von vielen Tumorzellen exprimiert werden von entscheidender Bedeutung. CIK-Zellen exprimieren LFA-1 und die Aktivierung der T- Lymphozyten führt zu einer erhöhten Avidität von LFA-1 seine Liganden zu binden [76, 80].

Weitere Apoptose-induzierende Mechanismen von sowohl T- als auch NK-Zellen sind der Fas/Fas-Ligand- und der TRAIL/TRAIL-Rezeptor (TNF-related apoptosis-inducing ligand)-Signalweg. CIK-Zellen exprimieren TRAIL, die Lyse über diesen Effektormechanismus spielt jedoch eine untergeordnete Rolle.

Letztlich verläuft die zellvermittelte Zytotoxizität der CIK-Zellen maßgeblich über den MHC-unabhängigen Effektormechanismus des NKG2D Rezeptors, wobei die TCR- vermittelte Zytotoxizität erhalten bleibt und die CIK-Zellen somit durch eine duale Spezifität charakterisiert sind (Abb. 1.8) [77].

Abb. 1.8: Duale Spezifität der CIK-Zellen. Die zellvermittelte Zytotoxizität der CIK-Zellen verläuft maßgeblich über den MHC-unabhängigen Mechanismus des aktivierenden NK-Zell Rezeptors NKG2D und die dadurch vermittelte Lyse durch zytotoxische Granula. Die MHC-restringierte Antigenerkennung über den TCR und dessen Zytotoxizitäts-Potential bleibt jedoch erhalten (Abbildung entnommen und verändert von Pfirrmann [81]; CIK=Zytokin-induzierte Killer, MHC=Haupthistonkompatibilitätskomplex, TCR=T-Zell Rezeptor).

Die Effektivität der CIK-Zell vermittelten Zytotoxizität konnte sowohl in vitro als auch in vivo im Mausmodell gegen eine Vielzahl an Tumor Zelllinien und auch gegen frisch isolierte autologe und allogene Tumor Isolate von verschiedenen Arbeitsgruppen bestätigt werden [82]. Im Mausmodell konnte die Effektivität der Zellen gegen Lymphom-, CML-, AML- und Rhabdomyosarkomzellen demonstriert und somit auch die erfolgreiche in vivo Applikation bestätigt werden [70, 83, 84]. Die Resistenz von prä-B-ALL-Blasten gegenüber CIK-Zellen zeigt jedoch, dass die Toxizität der Zellen durchaus limitiert ist [69, 85].

1.5.2 CIK-Zellen in der klinischen Anwendung/Studien

Die adoptive Immuntherapie in Form von CIK-Zellen bei hämatologischen Grunderkrankungen im allogenen Transplantationssetting hat in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Mehrere klinische Phase I/II-Studien konnten mittlerweile die Durchführbarkeit, Effektivität und Sicherheit von CIK-Zellen als immuntherapeutischen Ansatz bestätigen. Aktuell wird in Frankfurt a.M. eine multizentrische, nicht-randomisierte prospektive Studie durchgeführt, die den klinischen Einsatz von CIK-Zellen bei pädiatrischen und adulten Patienten in Hinblick auf Durchführbarkeit, Sicherheit und Effektivität evaluieren und bewerten soll (Titel der Studie: A prospective phase I/II study to investigate the feasibility, safety and efficacy of IL-15 activated cytokine induced killer (CIK) cells in relapsing patients with acute leukemia or myelodysplastic syndromes after allogeneic stem cell transplantation;

EudraCT Nummer: 2013-005446-11). In die Studie eingeschlossen werden Patienten mit akuter Leukämie oder MDS, die nach allogener SZT im peripheren Blut oder im Knochenmark molekulare oder zytogenetische Anzeichen eines Rezidivs aufweisen. Die CIK-Zell Infusion findet alle 4-6 Wochen entsprechend eines Dosis-Eskalations-Plans (Abb. 1.9) statt. Hinsichtlich der Sicherheit und Durchführbarkeit (primary objectives) von steigenden CIK-Zell Dosen, wird das Auftreten einer aGvHD Grad III oder IV oder einer erheblichen cGvHD beurteilt. Die Einteilung erfolgt nach den von Glucksberg festgelegten Kriterien. Die Bewertung der Effektivität (secondary objectives) erfolgt u.a. aufgrund der Überlebensraten und der Reduktion oder des Verschwindens des MRDs und der krankheitsspezifischen zytogenetischen Marker. Vor Beginn der Studie wurden in Frankfurt a.M. CIK-Zellen im Rahmen von Einzelheilversuchen im haploidenten Transplantationssetting mit T-Zell Dosen von bis zu 1 x 10⁸/kg verabreicht. Innerhalb dieser Einzelheilversuche konnte die sichere Durchführbarkeit von CIK-Zellen im haploidenten Setting bestätigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Applikation von hohen T-Zell Dosen im Vergleich zur Gabe von DLIs keine schwerwiegenden GvHD-Reaktionen induzieren. 2007 veröffentlichten Introna et al. eine Phase I/II-Studie, in der 11 rezidivierte Patienten (hämatologisches oder molekulares Rezidiv) nach SZT, die verschiedene maligne hämatologische Grunderkrankungen aufwiesen, mit CIK-Zellen behandelt wurden. Insgesamt wurden die CIK-Zell Gaben gut toleriert und 3 Patienten erreichten eine komplette Remission. Es wurden keine akuten und späten infusionsbedingten Nebenwirkungen oder schwere akute GvHD-Entwicklungen

beobachtet [86]. Laport et al. konnten 2011 in einer Phase I-Studie mit 18 Patienten ebenfalls zeigen, dass diese Form der adoptiven Immuntherapie gut toleriert wird, nur eine geringe Inzidenz für die Entwicklung einer GvHD besteht und dass der GvL/T Effekt in Hochrisiko Patienten durch die Gabe der Zellen verstärkt werden kann [87]. Für die Evaluierung der Durchführbarkeit, Zytotoxizität und Effektivität führten Linn et al. 2012 eine klinische Phase I/II-Studie durch. In diesem Zusammenhang wurden 16 Patienten mit hämatologischen Malignitäten, die nach allogener SZT rezidivierten, behandelt.

Eingeschlossen wurden Patienten, die nicht auf die Chemotherapie oder die Gabe von konventionellen DLIs ansprachen. In 5 Patienten wurde ein Ansprechen auf die CIK-Zell Therapie beobachtet und auch hier konnte gezeigt werden, dass das Risiko einer GvHD im Vergleich zur konventionellen DLI äußerst gering ist [88]. Die erst kürzlich veröffentlichte Phase IIA-Studie von Introna et al. zeigt die Kombination der DLI-Therapie mit anschließenden CIK-Zell Gaben. 74 Patienten, die nach allogener SZT ein zytogenetisches oder molekulares Rezidiv zeigten wurden mit unmanipulierten Spender DLI Gaben (2 Gaben á 1 x 10⁶/kgKG) gefolgt von Spender-CIK-Zell Infusionen (3 Gaben nach Dosis- Eskalations-Plan) behandelt. Ein kompletter Response wurde in 19 Patienten beobachtet (26%) und das Gesamtüberleben nach einem und drei Jahren betrug 51% bzw. 40%. Die Ergebnisse zeigten, dass kleine Mengen an DLIs gefolgt von Spender-CIK-Zellen einen sicheren Behandlungsplan mit signifikanter klinischer Aktivität in Patienten mit niedriger Tumorlast darstellen. Die Inzidenz schwerer akuter oder chronischer GvHD war bemerkenswert niedrig. Im Vergleich zur Standard DLI repräsentiert das limitierte Auftreten schwerer GvHD den wohl größten Vorteil dieses zellulären Therapie-Plans [89].

Abb. 1.9: Schema der CIK-Zell Studie. In einer prospektiven Phase I/II Studie soll die Durchführbarkeit, Sicherheit und Effektivität von IL-15 aktivierten CIK-Zellen in Patienten mit akuter Leukämie oder MDS, die Anzeichen eines molekularen oder zytogenetischen Rezidivs nach allogener SZT haben, untersucht werden. Im Schema sind die Einschlusskriterien, der Dosis-Eskalationsplan, der Behandlungsablauf, die begleitenden Analysen und die Endkriterien dargestellt (Abbildung aus dem Studienprotokoll, Protokoll Kennzahl Nummer: FFM – CIK-Zell Studie 01, Protokoll Version 3.0, Versionsdatum: 07.07.2017, EudraCT Nummer: 2013-005446-11).