Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie (auch fluorescent activated cell sorting, FACS genannt) ist ein Messverfahren, um Zellen anhand ihrer Größe, Struktur, Oberflächeneigenschaften und auch intrazellulären Zusammensetzung charakterisieren zu können. Innerhalb von Sekunden können 1000 Zellen analysiert werden. Bei den meisten Anwendungen beruht das Prinzip auf einer Antigen-Antikörper Reaktion, die mittels Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern gegen eine spezifische Struktur durchgeführt wird. Die Antikörper können direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sein (direkte Markierung) oder mit einem fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörper (indirekte Markierung) nachgewiesen werden.

Das Messprinzip beruht darauf, dass die Zellen einzeln in einem laminaren Probenstrom einen fokussierten, monochromatischen Laserstrahl passieren, der die Zellen anregt.

Dadurch wird das Licht gestreut und reflektiert und anschließend separat detektiert. Das Vorwärtsstreulicht bzw. der forward scatter (FSC) beschreibt die nach vorne abgelenkten Strahlen und ist ein Maß für die Größe der Zellen. Das Seitwärtsstreulicht oder auch der sideward scatter (SSC) ist ein Maß für das im 90° Winkel abgestrahlte Licht und beschreibt die Granularität der Zellen. Sind die Zellen zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, absorbiert das Fluorochrom einen Teil des Lichts und emittiert Fluoreszenzlicht einer höheren Wellenlänge (Abb. 3.2). Dabei besitzt jeder Farbstoff ein charakteristisches Emissionsspektrum (Tabelle 3.8). Auf diese Weise ist es möglich, die Koexpression von verschiedenen Antigenen auf der Oberfläche einer Zelle innerhalb einer Messung nachzuweisen. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird von einem System aus verschiedenen Spiegeln und Filtern nach Wellenlängenbereichen getrennt. Um auftretende spektrale Überlappungen zu verrechnen, müssen die Filter sehr sensitiv sein und Licht einer bestimmten Wellenlänge durchlassen aber dabei das Licht anderer Wellenlängen herausfiltern. Anschließend wird das nach Wellenlängen aufgeteilte Licht von den jeweiligen Detektoren erfasst und in elektrische Signale umgewandelt. Die Fluoreszenzintensität korreliert mit der Dichte der Antigenexpression [93].

Tab. 3.8: Fluoreszenzfarbstoffe.

Fluorochrom Emissionsmaximum [nm]

7-AAD (7-Aminoactinomycin D) 660 nm

APC (Allophycocyanin) 660 nm

APC-A700 (APC-Alexa Fluor 700) 719 nm APC-A750 (APC-Alexa Fluor 750) 780 nm

APC-Cy7 (APC-Cyanin 7) 785 nm

APC-H7 785 nm

BD Horizon™ V450 448 nm

BD Horizon™ V510 510 nm

ECD (PE-Texas Red) 620 nm

FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) 520 nm

KO (Krome Orange™) 528 nm

PB (Pacific Blue) 455 nm

PC5.5 (PE-Cyanin 5.5) 694 nm

PC7 (PE-Cyanin 7) 767 nm

PE (Phycoerythrin) 578 nm

PerCP (Peridinin Chlorophyll) 678 nm

Abb. 3.2: Messparameter und Darstellungen in der Durchflusszytometrie. (A) Tritt das Licht des Lasers auf die Zelle auf, wird es nach vorne (FSC=Forward scatter) und zur Seite (SSC=Side scatter) abgelenkt und gibt dabei Auskunft über Größe und Granularität der Zelle. Die Expression von Antigenen kann über Fluoreszenz-gekoppelte Antikörper nachgewiesen werden. (B) Darstellungsmöglichkeiten von durchflusszytometrischen Messungen. Zweidimensionale Ebene: Dot Plot (Punkt Diagramm) und Density Plot (Dichte Diagramm); eindimensionale Ebene: Histogramm (eigene Abbildung).

Phänotypisierung von CIK-Zellen mittels 10-Farb Durchflusszytometrie

Die Immunphänotypisierung ist ein Nachweis zur Expression von Antigenen auf der Zelloberfläche mittels monoklonaler fluorochrom-konjugierter Antikörper und durchflusszytometrischer Methoden. Bei den Antigenen handelt es sich um membrangebundene Glykoproteine, sogenannte CD-Marker (cluster of differentiation), die verschiedene Eigenschaften und Funktionen besitzen und zellspezifisch exprimiert werden.

Sie ermöglichen die Unterteilung der Lymphozyten in bestimmte Subpopulationen (Tabelle 3.9).

Tab. 3.9: Einteilung der Leukozyten Subpopulationen anhand ihrer Antigenexpression.

Subpopulation Antigenexpression

T Zellen CD3⁺

T-Helfer Zellen CD3⁺CD4⁺

Zytotoxische T Zellen CD3⁺CD8⁺

T-NK Zellen CD3⁺CD56⁺

Doppelt negative (DN) T-NK Zellen CD3⁺CD56⁺CD4^-CD8

-Naive Zellen CD45RA⁺CD62L⁺

Zentrale Gedächtniszelle CD45RO⁺CD62L⁺ Effektor Zellen (terminal differenziert) CD45RO⁺CD62L

-Effektor RA⁺ Zellen CD45RA⁺CD62L

-NK Zellen CD56⁺CD3

-B Zellen CD19⁺

Monozyten CD14⁺

Für die Bestimmung der Subpopulationen und des Gedächtnis-Phänotyps der CIK-Zellen wurde mit einem 10-Farb Panel gearbeitet, das den Einsatz von zehn verschiedenen Antikörpern parallel ermöglicht. Dabei wurde nach untenstehendem Schema vorgegangen (Abb. 3.3). Um die toten Zellen von den lebendigen zu diskriminieren, wurde der Vitalfarbstoff 7-AAD (7-Aminoactinomycin) verwendet, der ausschließlich in die DNA von toten Zellen interkaliert. Die Messung wurde mit einer single platform-Methode durchgeführt, die eine Zellzahlbestimmung/µl (Absolutzellzahl) während der durchflusszytometrischen Messung ermöglicht. Als interner Standard dienten Beads (Flow-Count® Fluorespheres), die 1:1 mit der Probe vermischt wurden, um so durch die

definierte Beads-Konzentration pro Volumeneinheit die genaue Zellzahl der Probe zu ermitteln.

Laser blauer Laser roter Laser violetter Laser

Fluoreszenz FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL9 FL10

Abb. 3.3: Pipettierschema für die Immunphänotypisierung der CIK-Zellen. Verwendete Antikörper mit jeweiliger Menge und Fluorochrom des 10-Farb Panels zur Phänotypisierung der CIK-Zellen.

Die Phänotypisierung der CIK-Zellen erfolgte an Tag 0 und 15 der Kultur. Im ersten Schritt wurde die vom Hersteller empfohlene Menge an Antikörpern (Abb. 3.3) in einem FACS® Röhrchen vorgelegt. Anschließend wurden 100 µl Probe (ca. 1 x 10⁵ Zellen) dazu pipettiert, gevortext und 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Zwischenzeitlich wurden die Beads gut gevortext und nach Ablauf der Inkubationszeit 100 µl Beads zur Probe gegeben.

Der Ansatz wurde mit 500 µl PBS + 5% HSA aufgefüllt und die Messung wurde anschließend am Navios Durchflusszytometer durchgeführt und mit der Navios Software 1.3 ausgewertet.

Bestimmung von EBV-spezifischen Zellen mittels MHC-Dextramer® und -Tetramer

Zur Detektion antigen-spezifischer T-Zellen wurden fluoreszenzmarkierte MHC-Multimere verwendet. Diese Technologie basiert auf der spezifischen Interaktion zwischen den TCRs der T-Zellen und den MHC-Peptid Komplexen der APCs. Ein einzelner TCR hat nur eine geringe Affinität für den MHC-Komplex. Der Einsatz von Multimeren ermöglicht jedoch eine simultane Bindung von mehreren TCRs einer einzelnen T-Zelle und sorgt für eine stabile Bindung zwischen T-Zelle und MHC-Komplex. MHC-Multimere sind Antikörper, die sich aus mehreren strukturell gleichen MHC-Komplexen zusammensetzen. Dabei besteht jede MHC-Einheit aus einem MHC-Molekül und einem

antigen-spezifischen Peptid. Diese Einheiten sind an eine Grundstruktur gebunden und werden je nach Art der Grundstruktur und Anzahl der MHC-Einheiten als Tetramere, Pentamere oder Dextramere bezeichnet. Die Kopplung von Fluorochromen an die Grundstruktur ermöglicht eine durchflusszytometrische Detektion der Zellen. Die Technologie ermöglichte anfänglich nur die Detektion von antigen-spezifischen zytotoxischen CD8⁺ T-Zellen. Mittlerweile ist jedoch auch ein umfassendes Sortiment an MHC-Klasse-II Komplexen verfügbar, um CD4⁺ T-Zellen zu detektieren. Des Weiteren sind indessen für eine Vielzahl an Virusinfektionen (AdV, CMV, EBV, HIV, Hepatitis B und C und Influenza) und für Autoimmun- und Tumorerkrankungen epitop-spezifische Multimere erhältlich.

Für die Detektion EBV-spezifischer CD8⁺ T-Zellen wurden MHC-Dextramere®

verwendet. Diese bestehen aus einem Dextran-Grundgerüst und sind PE konjugiert (Abb.

3.4). Im Vergleich zu anderen Multimeren besitzen sie eine erhöhte Anzahl an MHC-Einheiten und Fluorochromen. Dadurch können sie mit mehreren TCRs einer einzelnen T-Zelle gleichzeitig interagieren und ermöglichen aufgrund der erhöhten Avidität zu den virus-spezifischen Zellen eine stabilere Bindung.

Abb. 3.4: Aufbau eines MHC-Dextramers®. MHC-Dextramere bestehen aus einem Dextran-Grundgerüst an das verschiedene Anzahlen von MHC-Einheiten gekoppelt sind, die antigen-spezifische Peptide präsentieren. Durch die zusätzliche Kopplung von Fluorochromen an das Grundgerüst wird eine durchflusszytometrische Detektion ermöglicht (Abbildung entnommen und übersetzt aus den Herstellerangaben der Dextramer® Technologie, Immudex [94]).

Durch den Einsatz des EBV Consensus Peptid-Pools, konnten Dextramere mannigfacher Allele (A*02:01, B*07:02, B*08:01 und B*35:01) und Peptidsequenzen (BMLF1, BMRF1, EBNA1, EBNA3A und LMP2A) genutzt werden (Tabelle 3.5). Alle Dextramere waren PE konjugiert. Die Frequenz der virus-spezifischen T-Zellen innerhalb der CIK

Röhrchen überführt und mit 2 ml PBS + 0,5% HSA gewaschen (5 min, 300 g, 8/7, RT).

Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen für 10 min bei RT im Dunkeln mit 5 µl des jeweiligen Dextramers inkubiert. Da alle Dextramere PE konjugiert waren, musste jedes Dextramer einzeln angesetzt werden. Anschließend wurden pro Ansatz 1 µl CD4 APC A750, 2,5 µl CD8 APC A700, 5 µl CD3 APC, 5 µl CD45 KO und 10 µl 7AAD dazu pipettiert und für 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Ansätze nochmals mit 2 ml PBS + 0,5% HSA gewaschen (5 min, 300 g, 8/7, RT) und abschließend in 350 µl PBS + 0,5% HSA aufgenommen. Die Messung erfolgte am Navios Durchflusszytometer und die Auswertung mit der dazugehörigen Navios Software. Um die Grenze der Negativ/Positiv Fraktion richtig setzten zu können, wurde immer eine Negativ-Kontrolle mitgeführt. Dafür wurden Zellen eingesetzt, die genau gleichbehandelt, aber nicht Dextramer-gefärbt wurden (fluorescence minus one, FMO).

Für die Detektion EBV-spezifischer CD4⁺ T-Zellen wurde ein ProM2^™ MHC-II Monomer eingesetzt. ProM2^™ Monomere sind biotinyliert und können durch die Zugabe eines Streptavidin-markierten Farbstoffes (R-PE oder APC) in MHC-Tetramere umgewandelt werden. Das in dieser Arbeit verwendete Monomer bindet die EBV Peptidsequenz des EBNA1 Antigens (AEGLRALLARSHVER) und ist spezifisch für das Allel DRB1*04:01.

Um das biotinylierte Monomer mit dem streptavidin-markierten R-PE zu konjugieren, wurde in einem ersten Schritt das Streptavidin-R-PE bei 4°C und 14000 g für 3 min zentrifugiert. Auf diese Weise wurden Protein-Aggregate entfernt, die zu nicht-spezifischer Bindung führen können. Anschließend wurden 13 µl des Streptavidin-R-PE (0,8 mg/ml) zu 35 µg des Monomers gegeben, vorsichtig gemischt und für 15 min bei 4°C inkubiert.

Dieser Schritt wurde noch viermal wiederholt. Für ein finales Volumen von 400 µl wurde mit PBS + 0,1% Natriumazid aufgefüllt. Für die Färbung an Tag 0 und 15 wurden 1 x 10⁶ Zellen aus der Kultur in ein FACS® Röhrchen überführt und mit 2 ml Waschpuffer (PBS + 0,1% Natriumazid und 0,1% BSA) gewaschen (5 min, 300 g, 8/7, RT). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen mit 5 µl des Tetramers für 2 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Zellen erneut mit 2 ml Waschpuffer gewaschen (5 min, 300 g, 8/7, RT). Anschließend wurden wie bei der Detektion der CD8⁺ virus-spezifischen Zellen 1 µl CD4 APC A750, 2,5 µl CD8 APC A700, 5 µl CD3 APC, 5 µl CD45 KO und 10 µl 7AAD dazu pipettiert und für 20 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Nach einem abschließenden Waschschritt erfolgte die Messung und Auswertung am Navios

Durchflusszytometer mit der entsprechenden Software. Auch hier wurde als Negativ-Kontrolle eine FMO-Färbung eingesetzt.

Expression von NKG2D auf EBV+ CIK-Zellen

Zur weiteren Charakterisierung der CIK-Zellen wurde die Expression des NKG2D Rezeptors auf EBV+ T-, T-NK und NK-Zellen innerhalb der CIK-Zellkultur untersucht.

Dazu wurden an Tag 15 1 x 10⁶ Zellen aus der Kultur entnommen, in ein FACS®

Röhrchen überführt und wie im vorherigen Abschnitt beschrieben mit einem EBV-spezifischen Dextramer gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit 2,5 µl CD56 PC7 und jeweils 5 µl CD3 ECD, CD45 KO und NKG2D APC für 15 min bei RT inkubiert. Für die Messung am Navios Durchflusszytometer wurden 350 µl PBS + 0,5% HSA zu den Ansätzen gegeben. Die Auswertung erfolgte auch hier mit der Navios Software.