Die Ausprägung eines bestimmten immunologischen Phänotyps wird vor allem durch Zytokine und immunogene Antigene beeinflusst. Die Generierung der CIK-Zellen unter Verwendung des konventionellen Herstellungsprotokolls beinhaltet die Stimulation der PBMCs mit IL-2 und IL-15. Über 90% der Zellen entwickeln während der Expansion einen CD3+ Phänotyp und die Mehrheit der T-Zellen exprimiert das CD8 Antigen. IL-2 und IL-15 stimulieren beide die Proliferation verschiedener T-Zell Subpopulationen und spielen eine wichtige Rolle in der Generierung und Aufrechterhaltung von NK-Zellen. IL-15 wirkt durch einen heterotrimeren Rezeptor, der sich aus der allgemeinen Zytokin-Rezeptor γ-Kette (CD132), dem IL-2/IL-15 Zytokin-β (IL-15Rβ) und der Zytokin- Rezeptor-Untereinheit IL-15Rα zusammensetzt. Die CD132 und IL-15Rβ Rezeptor-Untereinheit hat IL-15 mit IL-2 gemeinsam. Durch die Stimulation mit IL-15 kann der zytotoxische Charakter der CIK-Zellen weiter ausgeprägt werden. Außerdem unterstützt IL-15 das Überleben von CD8+ Gedächtniszellen und spielt eine kritische Rolle in der Aufrechterhaltung von langanhaltenden hoch-affinen T-Zell Antworten gegenüber Pathogenen [103]. Die Proliferation der für CIK-Zellen charakteristischen Subpopulation an CD3+CD56+ T-Zellen wird durch IL-15 gesteigert. Im Gegensatz zu IL-2 unterdrückt es außerdem die Proliferation unerwünschter regulatorischer T-Zellen [104].
In dieser Arbeit sollte das Rezeptorrepertoire und der immunologische Phänotyp konventioneller CIK-Zellen im Vergleich zu EBV-stimulierten CIK-Zellen untersucht werden. Da die zusätzliche Stimulation mit EBV Peptid bei den 12 analysierten individuellen Spendern keinen signifikanten Einfluss auf die Ausbildung des Phänotyps hatte, wird im nachfolgenden nur der immunologische Phänotyp der EBVCons CIK-Zellen beschrieben.
Wie bereits mehrfach in der Literatur beschrieben, exprimierte der Großteil der Zellen nach Expansion einen CD3+ Phänotyp. Die Expression des CD56 Antigens stieg im Laufe der Expansionsphase signifikant an und somit auch die für CIK-Zellen charakteristische Population der CD3+CD56+ T-NK Zellen. Ein weiteres Merkmal der CIK-Zellen ist, dass die Expression des CD4 Antigens ab- und die des zytotoxischen CD8 Antigens zunimmt.
Am Ende der Kultur konnten ca. 80% der T-Zellen als zytotoxische CD8+ Zellen identifiziert werden. Auch innerhalb der T-NK Zellen exprimierte der Großteil der Zellen das CD8 Antigen und nur ein verschwindend geringer Anteil das für T-Helferzellen
charakteristische CD4 Antigen. Auffällig war jedoch, dass sich bei 20% der T-NK Zellen eine Population identifizieren ließ, die weder das CD4 noch das CD8 Antigen trug. Diese Zellen bezeichnet man als doppelt negative Zellen (DN). Das Vorkommen und die Funktion der DN T-Zellen werden in der Literatur jedoch relativ kontrovers diskutiert.
Studien haben gezeigt, dass selbst diese kleine Population heterogen sein und verschiedene Subpopulationen enthalten kann. So können die DN Zellen genau wie die klassischen T-Zellen entweder den αβ- oder γδ-Phänotyp exprimieren. Den αβ DN T-T-Zellen im Menschen wurden sowohl regulatorische Funktionen wie auch inflammatorische Effekte zugeordnet [105]. In einer Publikation von Young et al. werden die DN T-Zellen als mögliche neue zelluläre Immuntherapie für Tumore beschrieben, da sie das Auftreten einer GvHD abschwächen können aber gleichzeitig eine anti-Tumor Wirkung zeigen [106]. Die potentielle Funktion der DN T-Zellen innerhalb der CIK-Zellen könnte demnach aufgrund der geringen Alloreaktivität der CIK-Zellen in vivo in einer immunsuppressiven Wirkung liegen.
In Bezug auf den Aktivierungsgrad der Zellen wurde die Expression des aktivierenden Rezeptors NKG2D und das für aktivierte Zellen charakteristische CD25 Antigen untersucht. Über 85% der T-Zellen und sogar über 95% der T-NK Zellen exprimierten NKG2D auf ihrer Oberfläche. Im Vergleich zu den EBV-negativen T-Zellen innerhalb der EBVCons CIK-Zellkultur exprimierten die EBV-positiven T-Zellen signifikant mehr NKG2D auf ihrer Oberfläche. Innerhalb der T-NK Zellen war dieses Phänomen nicht zu beobachten. CD25 wurde anfänglich auf beiden Populationen kaum exprimiert aber nahm zum Ende der Kultivierung signifikant zu. Die deutliche Aktivierung der Zellen lässt sich durch die proliferierende und aktivierende Wirkung von IL-2 und IL-15 erklären.
Hinsichtlich ihres TCRs exprimierten über 90% der T-Zellen einen αβ-Phänotyp und nur in sehr geringem Maße γδ. Bei den T-NK Zellen verhielt es sich anders. Diese exprimierten am Ende der Kultur zu 70% αβ-TCRs und im Vergleich zu den T-Zellen einen relativ hohen Anteil (ca. 30%) an γδ-TCRs. Zellen, die γδ-TCRs exprimieren werden mit einem niedrigen alloreaktiven Potential assoziiert und sind in der Lage verschiedene maligne Zelltypen anzugreifen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sie selbst über die MHC-Barriere hinweg keine GvHD induzieren [107]. Diese Erkenntnis wird zurzeit in einem Ansatz zur Herstellung haploidenter Transplantate genutzt, in dem αβ-positive T- und CD19-Zellen selektiv depletiert werden. Die γδ-positiven Zellen verbleiben jedoch im
CIK-Zellen eine unterstützende Funktion beim Killing von malignen Zellen zugeschrieben, welche der T-Zellantwort durch Runterregulierung ihres Klasse-I Antigens entkommen.
Der relativ hohe Anteil an γδ innerhalb der T-NK Zellen könnte demnach im Zusammenhang mit dem niedrigen alloreaktiven Potential der CIK-Zellen stehen.
Ziel der allogenen zellulären Immuntherapie ist es, immunologische Effektorzellen (in Form von T- und/oder NK-Zellen) ex vivo zu expandieren um diese dann dem Patienten zu applizieren. Durch die Aktivierung sollen diese in vivo einen GvL/T Effekt ausüben und ein immunologisches Gedächtnis entwickeln bei gleichzeitig niedrigem Risiko einer GvHD Induktion. Vorteil der CIK-Zellen ist, dass sie eine Mischpopulation darstellen, die hauptsächlich in zwei Untergruppen aufgeteilt werden kann. Die CD3+CD56+ CIK-Zellen sind terminal differenzierte Effektorzellen mit nicht-MHC-restringierter NKG2D Rezeptor-vermittelter Zytotoxizität und niedriger proliferativer Kapazität, wohingegen CD3+CD56- CIK-Zellen eine reduzierte Zytotoxizität aber dafür eine hohe proliferative Kapazität aufweisen [108, 109]. Im Vergleich zu T-Zellen Therapien in Form von z.B.
DLIs vermitteln sie eine hohe zytotoxische Kapazität bei gleichzeitig geringem alloreaktivem Potential.
Der Gedächtnis-Phänotyp EBV-spezifischer CIK-Zellen
Die Reifung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu reifen T-Zellen findet im Thymus statt. Dort werden naive T-Zellen, die noch keine Antigen-Spezifität besitzen, gebildet. Diese sind charakterisiert durch die Expression der Isoform RA des Oberflächenmarkers CD45 und des Homing-Rezeptors L-Selektin (CD62L). Letzterer befähigt die Zellen in lymphatisches Gewebe zu migrieren. Dort können sie durch Antigen-Kontakt selektiv aktiviert werden (Priming). Kommt es zu einer Aktivierung der T-Zellen, wird das L-Selektin abgebaut und die Zellen können nun nicht mehr in den Lymphknoten migrieren [110]. Effektor Gedächtniszellen, die in der Peripherie zirkulieren, haben den Marker CD62L durch die Aktivierung verloren. Sie sind terminal differenziert und exprimieren die Isoform RO des CD45 Markers. Zentrale Gedächtnis T-Zellen hingegen sind bereits spezifisch für ein Antigen und exprimieren ebenfalls CD45RO und zusätzlich wieder CD62L. Dadurch sind sie in der Lage in lymphatisches Gewebe zu migrieren, um von dort aus bei erneutem Antigen-Kontakt rasch zu proliferieren und eine
Immunantwort zu induzieren. EMRA Gedächtniszellen gehen aus Effektor Zellen hervor und exprimieren noch oder wieder die Isoform RA [111].
In einer Publikation von Franceschetti et al. wurden die CIK-Zellen als CD3+CD56+ Zellen mit phänotypischen Charakteristika, die typisch sind für terminal differenzierte CD8+ Effektor Gedächtnis T-Zellen beschrieben (TEMRA hier: CCR7-, CD45RA+, CD62Llow) [79]. In Hinblick auf den Gedächtnisphänotyp der T-Zellen innerhalb der EBVCons CIK-Zellen ist festzustellen, dass die naiven T-CIK-Zellen sowohl bei den CD4+ als auch den CD8+ T-Zellen während der Expansion deutlich abnahmen und die Zellen sich am Ende der Kultur zu einem Effektor Gedächtnistyp differenzierten. Bemerkenswert ist jedoch, dass die CD4+ T-Zellen nahezu keinen EMRA Gedächtnistyp exprimieren, wohingegen dieser bei den CD8+ T-Zellen einen Anteil von ca. 15% ausmachte. Der Anteil an zentralen Gedächtnis Zellen ist dagegen bei den CD4+ Zellen sowohl am Anfang wie auch nach der Expansion doppelt so hoch wie bei den CD8+ Zellen. Die T-NK Zellen der EBVCons CIK-Zellen exprimierten zu fast 50% einen Effektor-Gedächtnistyp. Der EMRA Gedächtnistyp (CD45RA+CD62L-) war an Tag 0 der Kultur zu ca. 25% nachweisbar aber nahm im Laufe der Expansion auf im Mittel 10% ab. Neben den Effektor Gedächtniszellen exprimierten die EBVCons CIK-Zellen zu etwa 20% einen zentralen Gedächtnisphänotyp. Geginat et al.
haben gezeigt, dass die Stimulation mit IL-15 die Expansion von Effektor Gedächtnis Zellen steigert, während die von zentralen und naiven Gedächtnis Zellen nicht unterstützt wird [112]. Des Weiteren konnten sie zeigen, dass zentrale Gedächtnis Zellen in einem Antigen-unabhängigen Weg Effektor Gedächtnis Zellen generieren können. Zusätzlich vermuten sie, dass die zentralen Gedächtnis Zellen sich selbst erneuern und den Pool an Effektorzellen auffüllen können. Diese Ergebnisse passen zu dem hier beschriebenen Gedächtnisphänotyp der EBVCons CIK-Zellen und bestätigen deren effektorischen Charakter. Jedoch konnten trotz der aktivierenden Stimulanzien nicht alle Zellen terminal differenziert werden. Die nicht-terminal differenzierten Zellen verfügen jedoch über das Potential in vivo reaktiviert zu werden und fungieren sozusagen als zytotoxisches Backup.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die EBVCons CIK-Zellen primär einen CD3+ T-Zell Phänotyp exprimieren, der wie der wachsende Anteil an T-NK Zellen größtenteils aus zytotoxischen CD8+ Zellen besteht. Von Bedeutung ist außerdem der relativ hohe Anteil an DN und γδ T-NK Zellen. Der Gedächtnisphänotyp bestand hauptsächlich aus terminal differenzierten Effektor Gedächtnis Zellen, aber auch aus zentralen Gedächtnis