Partielle Komplementation der ∆cib1 Mutante durch XBP1 aus Homo sapiens . 19

In Wirbeltieren besteht die UPR aus einem komplexen Netzwerk von Signalwegen, die verschiedene zelluläre Antworten vermitteln. Die Regulation dieser Vorgänge wird durch die drei ER-Stresssensoren IRE1 (inositol requiring enzyme 1), ATF6 (activating transcription factor 6) und PERK (protein kinase RNA-like ER kinase), gesteuert (Hetz, 2012). Der in niederen Eukaryoten konservierte IRE1 Signalweg wird in H. sapiens durch den

Transkriptionsfaktor XBP1 (X-box binding protein 1), welcher homolog zu Hac1p aus S. cerevisiae ist, reguliert (Calfon et al., 2002).

Im Weiteren wurde eine mögliche Komplementation von ∆cib1 Stämmen durch Expression von XBP1 aus H. sapiens untersucht. Hierzu wurde die XBP1 cDNA (Mammalian Gene Collection) unter dem konstitutiv aktiven otef Promotor (Spellig et al., 1996) im FB1 ∆cib1 Stamm exprimiert. In der Analyse zeigte der ∆cib1 Stamm eine deutlich reduzierte ER-Stressresistenz im Vergleich zum WT (Abb. 10). Durch mehrfache Integration des XBP1 exprimierenden Plasmids (XBP1^(x)) in den ip Locus (Keon et al., 1991) kann die ER-Stressresistenz der ∆cib1 Mutante teilweise wiederhergestellt werden (Abb. 10). Durch diesen Ansatz konnten erste Hinweise auf eine mögliche funktionelle Übereinstimmung der UPR-Regulation zwischen U. maydis und H. sapiens erlangt werden.

Abb. 10: Komplementation der ∆cib1 Mutante durch XBP1 aus H. sapiens. 10-fach Verdünnungsreihen des FB1 Stammes und Derivate wurden auf YNB Festmedium getropft. ER-Stress wurde durch 2 μg/ml Tunicamycin (Tm) oder 2 mM DTT induziert. Für die Komplementationsanalyse wurde XBP1 unter Kontrolle des konstitutiv aktiven otef Promotors in den ip Locus der ∆cib1 Mutante integriert. (x) steht für eine mehrfache Integration des Plasmids in den ip Locus. Die Platten wurden 48 h bei 28°C inkubiert.

2.1.4 ER-Stress führt zum Spleißen der cib1 mRNA und zur Induktion des UPR-Zielgens bip1

Die bioinformatischen Analysen und die Komplementationsstudien von cib1 geben einen deutlichen Hinweis darauf, dass die Regulation des Ire1 abhängigen UPR-Signalwegs in U. maydis konserviert ist. Um diese Annahme weitergehend zu untersuchen, wurden umfangreiche qRT-PCR Analysen in U. maydis durchgeführt. Zum einen wurde das Spleißen der cib1 mRNA analysiert, indem die Expressionslevel der gespleißten (cib1^s) und ungespleißten (cib1^u) mRNA bestimmt wurden (siehe auch Abb. 14A). Zum anderen wurde die Aktivierung der UPR durch die Expressionslevel von UMAG_15034 ermittelt, das für das Ortholog des ER-Chaperon Kar2p/Bip1 (e-value: 0) kodiert. KAR2/BiP1 ist ein konserviertes UPR-Zielgen, und die Expression wird durch ER-Stress stark induziert (Normington et al., 1989; Rose et al., 1989).

Für die Analyse wurde der Stamm SG200 (WT) und verschiedene Derivate in YNB Flüssigmedium kultiviert und zur Induktion von ER-Stress mit Tunicamycin (Tm) oder

Dithiothreitol (DTT) behandelt. Bei SG200 handelt es sich um einen solopathogenen Stamm, der ein kompatibles b-Heterodimer exprimiert und somit ohne einen Kreuzungspartner Maispflanzen infizieren kann (Kämper et al., 2006).

In Abwesenheit von ER-Stress kann im WT eine Basalexpression der gespleißten cib1 mRNA (cib1^s) beobachtet werden. ER-Stress dagegen führt zu einer Induktion der Expression von cib1^s und bip1 (Abb. 11). Dies zeigt, dass ER-Stress das Spleißen der cib1 mRNA induziert, und die UPR aktiviert wird.

Im Gegensatz dazu kann im ∆cib1 Hintergrund keine bip1 Induktion durch ER-Stress beobachtet werden. Dies kann durch Integration von cib1 unter dem nativen Promotor in den ip Locus der ∆cib1 Mutante wiederhergestellt werden (Abb. 11). Aus diesen Beobachtungen kann man schließen, dass Cib1 essenziell für die ER-Stress abhängige Expression von bip1 ist.

Aus S. cerevisiae ist bekannt, dass unter ER-Stress die HAC1 mRNA durch Ire1p gespleißt wird (Cox und Walter, 1996). Die Deletion von UMAG_03481, dem möglichen ire1 Homolog aus Hefe (e-value: 1,6e-95), führt zu einem Verlust des Spleißens der cib1 mRNA, was durch das Fehlen der cib1^s Expression deutlich wird. Neben dem Spleißen ist eine Aktivierung der UPR, nachweisbar durch die Expression des UPR-Zielgens bip1 unter ER-Stress, ebenfalls blockiert (Abb. 11). Der Verlust der UPR-Aktivierung durch das fehlende Spleißen der cib1 mRNA unter ER-Stress bestätigt eine ire1 abhängige Regulation der UPR und deutet darauf hin, dass es sich bei UMAG_03481 um das funktionelle Homolog von Ire1p in S. cerevisiae handeln könnte.

Um zu überprüfen, ob die Expression der gespleißten und damit aktiven cib1 Form (cib1^s) ausreichend für die Aktivierung der UPR ist, wurde cib1^s unter Kontrolle des nativen Promotors in den ip Locus des WT und der ∆ire1 Mutante integriert. Die Expression von cib1^s im WT zeigt bereits in Abwesenheit von ER-Stress eine Induktion von bip1 und somit eine UPR-Aktivierung. Während durch Induktion von ER-Stress das Expressionslevel von cib1^s im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nochmals deutlich erhöht ist, bleibt das Expressionslevel von bip1 konstant (Abb. 11). Folglich sind die cib1^s Level in Abwesenheit von ER-Stress bereits ausreichend, um die bip1 Expression vollständig zu induzieren. Die Expressionslevel von cib1^u, cib1^s und bip1 im ∆ire1 cib1^s Stamm sind analog zum cib1^s Stamm (Abb. 11). Dies zeigt, dass die UPR durch cib1^s Expression unabhängig von ER-Stress und vom Spleißen der cib1 mRNA aktiviert werden kann.

Zusätzlich wurde cib1^s in den ∆cib1 Stamm eingebracht, womit getestet werden soll, ob die Expression von cib1^s ausreichend für die UPR-Regulation ist. In diesem Stamm konnte keine cib1^s Expression detektiert werden, und das Expressionsmuster entsprach der ∆cib1 Mutante (Abb. 11). Eine mögliche Erklärung ist, dass die Expression von cib1^s in diesem

Stammhintergrund letal ist, und dieser Stamm somit kein funktionelles cib1^s integriert hat (siehe 2.6.2).

Zusammenfassend konnte mit dieser initialen Expressionsstudie gezeigt werden, dass ER-Stress analog zu S. cerevisiae zum Spleißen der cib1 mRNA führt und die Expression des UPR-Zielgens bip1 aktiviert wird. Für eine Aktivierung der UPR ist sowohl cib1 als auch ire1 essenziell, da die Deletion dieser Gene den Verlust der Regulation zur Folge hat. Weiter ist die Expression von cib1^s im WT und ∆ire1 Stamm ausreichend um die UPR zu aktivieren.

Abb. 11: Die Genexpression von cib1^s, cib1^u und bip1 in den Stämmen SG200 und Derivaten unter ER-Stress. Die RNA wurde aus exponentiell wachsenden U. maydis Kulturen SG200 (WT) und Derivaten in YNB Flüssigmedium isoliert. ER-Stress wurde durch Zugabe von 5 µg/ml Tunicamycin (Tm) für 4 h bzw. 3 mM DTT für 3 h induziert. Die Expressionslevel wurden mittels qRT-PCR analysiert. Zur Untersuchung der UPR-Aktivierung wurden Primerpaare spezifisch für die gespleißte cib1 mRNA (cib1^s), ungespleißte cib1 mRNA (cib1^u) und bip1 (UMAG_15034) verwendet. Die Normalisierung der relativen Genexpression erfolgte unter Verwendung von eIF2b (UMAG_04869). Gezeigt sind die Mittelwerte von drei biologischen sowie zwei technischen Replikaten. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) an.