Die Expressionsanalyse weiterer UPR-Zielgene unter ER-Stress

In der initialen Expressionsstudie wurde festgestellt, dass ER-Stress in U. maydis zum Spleißen der cib1 mRNA und Induktion des UPR-Zielgens bip1 führt. Es ist bekannt, dass durch die Aktivierung der UPR weitere Zielgene aktiviert werden, um die Homöostase im ER zu gewährleisten (Travers et al., 2001). Durch Literaturrecherche und Sequenzvergleiche wurden vier weitere konservierte UPR-Zielgene identifiziert, welche in einer qRT-PCR Analyse auf eine UPR abhängige Regulation getestet wurden. Zu den vier UPR-Zielgenen zählen: UMAG_00904, was für das vorhergesagte Hefe Ortholog des ER-Chaperons Lhs1p (e-value: 1,0e-49) (Craven et al., 1996), UMAG_05352, was für das vorhergesagte Hefe Ortholog der Protein-Disulfid-Isomerase Mpd1p (e-value: 6,0e-25) (Tachikawa et al., 1995), UMAG_10287, das für das vorhergesagte Hefe Ortholog des Glycoprotein Chaperons Cne1p (e-value: 3,0e-65) (Travers et al., 2000) und UMAG_02729, welches für das vorhergesagte Ortholog der Plasmodium falciparum Signal-Peptide-Peptidase Spp1 (e-value: 3,0e-46) (Li et al., 2008), kodiert. Der Stamm ∆cib1 cib1^s wurde aus dieser Analyse ausgeschlossen, da die

entsprechenden Stämme bei der Überprüfung keine cib1^s Expression zeigten. Dies ist interessant, da in S. cerevisiae die Expression der gespleißten HAC1 Form möglich ist (Kimata et al., 2006).

Durch ER-Stress ist die Expression aller getesteten UPR-Zielgene signifikant induziert (Abb. 12). Die Deletion von cib1 oder ire1 hat den Verlust der ER-Stress abhängigen Regulation dieser UPR-Zielgene zur Folge (Abb. 12). Eine Ausnahme bilden cne1 und spp1 unter Tm induziertem ER-Stress, was auf eine unspezifische Induktion dieser Gene durch Tm hindeutet.

Durch die Expression von cib1 unter dem nativen Promotor, kann die Regulation aller getesteten Gene in der ∆cib1 Mutante (∆cib1 cib1) wieder vollständig hergestellt werden (Abb. 12). Dies lässt den Schluss zu, dass die Induktion der getesteten UPR-Zielgene abhängig von cib1 und ire1 reguliert wird.

In der initialen Expressionanalyse wurde festgestellt, dass die Expression von cib1^s ausreichend für die Induktion des Zielgenes bip1 ist. Übereinstimmend zeigte sich, dass die Expression der weiteren UPR-Zielgene im WT und ∆ire1 Hintergrund ebenfalls durch die cib1^s Expression unabhängig von ER-Stress induziert werden kann (Abb. 12).

Abb. 12: Die Expression von weiteren UPR-Zielgenen in den Stämmen SG200 und Derivaten als Antwort auf ER-Stress. Die RNA wurde aus exponentiell wachsenden U. maydis Kulturen SG200 (WT) und Derivaten in YNB Flüssigmedium isoliert. ER-Stress wurde durch Zugabe von 5 µg/ml Tm für 4 h bzw. 3 mM DTT für 3 h induziert. Die Expressionslevel der vier UPR-Markergene lhs1 (UMAG_00904), mpd1 (UMAG_05352), cne1 (UMAG_10287) und spp1 (UMAG_02729) wurden mittels qRT-PCR analysiert. Die Normalisierung der relativen Genexpression erfolgte unter Verwendung von eIF2b (UMAG_04869). Gezeigt sind die Mittelwerte von drei biologischen sowie zwei technischen Replikaten. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) an.

Als weiteres UPR reguliertes Zielgen konnte UMAG_05173 (dnj1) identifiziert werden (Abb. 13A), welches für ein ER-lokalisiertes Co-Chaperon der DnaJ Familie kodiert und Ähnlichkeiten zum humanen DnaJC3 (e-value 6,8e-45) aufweist. In Kollaboration mit dem Labor von Frau Prof. Regine Kahmann wurde eine mögliche Funktion von Dnj1 innerhalb der pathogenen Entwicklung untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Deletion von dnj1 zu einer deutlichen reduzierten Virulenz führt (Lo Presti et al., 2015a). ER-Stresstests zeigten eine

Inhibition des Wachstums von ∆dnj1 Stämmen unter Tm induzierten Stressbedingungen, wohingegen DTT induzierter ER-Stress keinen Einfluss auf das Wachstum von ∆dnj1 Stämmen im Vergleich zum verwendeten Kontrollstamm SG200 (WT) hat (siehe 6.2). Durch eine qRT-PCR Analyse sollte ein möglicher Einfluss der verschiedenen ER-Stressoren auf die Expression verschiedener UPR-Markergene in ∆dnj1 Stämmen untersucht werden.

Hierbei zeigte sich im ∆dnj1 Hintergrund eine signifikant erhöhte Basalexpression aller getesteten UPR-Markergene im Vergleich zum WT. Ein Einfluss auf die transkriptionelle Regulation der UPR-Markergene unter Tm oder DTT induziertem ER-Stress wurde jedoch nicht beobachtet (Abb. 13B).

Abb. 13: Die dnj1 Expression wird UPR abhängig induziert und die ∆dnj1 Mutante zeigt eine erhöhte basale UPR-Zielgenexpression. (A) qRT-PCR Analyse von dnj1 nach ER-Stress. Die RNA wurde aus exponentiell wachsenden U. maydis Stämme SG200 und SG200Δcib1 in YNB Flüssigmedium isoliert. ER-Stress wurde durch Zugabe von 5 µg/ml Tm für 4 h bzw. 3 mM DTT für 3 h induziert. (B) qRT-PCR Analyse von UPR-Zielgenen in SG200 und SG200Δdnj1. Die Zellen wurden wie in (A) beschrieben behandelt, und daraus die RNA isoliert. (C) qRT-PCR Analyse von bE, bW und der rbf1 Expression. Die Stämme SG200 und SG200∆dnj1 wurden auf Festmedium mit Aktivkohle kultiviert und nach zwei Tagen die RNA aus den Zellen isoliert. Die Normalisierung der relativen Genexpression aller gezeigten Analysen erfolgte unter Verwendung von eIF2b (UMAG_04869). Gezeigt sind die Mittelwerte von drei biologischen sowie zwei technischen Replikaten. Die Fehlerbalken geben die Standardfehler (SE) an. * geben den p-Wert an: * < 0,05, ** < 0,01 und *** < 0,001.

Eine erhöhte UPR-Basalaktivität führt zu einer Inhibition des filamentösen Wachstums auf aktivkohlehaltigem Festmedium, welche durch eine verringerte Expression der bE, bW und rbf1 Genexpression bedingt ist (Heimel et al., 2013). Aus diesem Grund wurde die Expression dieser Gene im ∆dnj1 Hintergrund mit dem des Ausgangsstammes SG200 (WT) verglichen. Hierbei zeigte sich eine signifikant reduzierte Expression aller drei Gene (Abb. 13C). Übereinstimmend mit diesen Untersuchungen zeigte die phänotypische Analyse eine leicht reduzierte Filamentbildung von ∆dnj1 Stämmen auf aktivkohlehaltigem Festmedium (Lo Presti et al., 2015a).

Zusammenfassend hat die Aktivierung der UPR in U. maydis die Induktion verschiedener konservierter UPR-Zielgene zur Folge, die in Abhängigkeit von cib1 und ire1 reguliert werden. Mit Dnj1 konnte darüber hinaus ein neuer UPR regulierter Virulenzfaktor identifiziert werden, dessen Funktion auch in dem phytopathogenen Ascomyceten Fusarium oxysporum konserviert ist (Lo Presti et al., 2015a).

2.2 Die Struktur des cib1 Gens und der kodierenden Proteine Cib1 und