Zur Herstellung transformationskompetenter Bakterienzellen wurde ein modifiziertes Protokoll nach Hanahan et al., 1991 verwendet. Es wurden 100 ml SOB-Medium mit 1 ml einer frischen TOP10 Übernachtkultur angeimpft und bis zu einer OD600 ≈ 0,5 bei 37°C und 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert (4.000 Upm, 10 min, 4°C), anschließend in einem Drittel des Ausgangsvolumens in eiskaltem CCMB80-Puffer aufgenommen und für 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut pelletiert (4.000 Upm, 10 min, 4°C) und in einem Zwölftel des Ausgangsvolumens resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in 50 μl Portionen aliquotiert und bei -80°C gelagert.
CCMB80-Puffer Plasmidlösung (1 - 5 ng Plasmid) oder dem Ligationsansatz versetzt und 10 - 15 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 30 - 60 s bei 42°C wurde der Transformationsansatz mit 200 μl dYT-Medium versetzt und 30 min bei 800 Upm und 37°C in einem Wärmeblock inkubiert. Die Inkubation in dYT-Medium bei 37°C wurde nicht bei einer Ampicillin-Resistenz durchgeführt. Anschließend wurde der Transformationsansatz auf YT-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
4.4.2 Transformation von S. cerevisiae nach Ito et al., 1983
25 ml YEPDA-Medium wurde mit einigen S. cerevisiae Einzelkolonien angeimpft und ü. N.
bei 30°C und 180 Upm inkubiert. Diese Vorkultur wurde in 50 ml YEPDA-Medium auf eine OD600 = 0,2 verdünnt und weitere 4 - 6 h bei 30°C und 180 Upm bis zu einer OD600 = 0,4 - 0,6 inkubiert. Um die Zellen zu ernten, wurde die Kultur in 50 ml Greiner-Röhrchen überführt und in einer Heraeus Biofuge Stratos bei Raumtemperatur abzentrifugiert (3 min, 2.000 Upm). Die Zellen wurden einmal mit 15 ml sterilem H2O und anschließend mit 10 ml SORB-Lösung gewaschen. Nach der Pelletierung wurden die kompetenten Zellen in 360 μl SORB-Lösung aufgenommen und mit 40 μl denaturierter (10 min bei 100°C) Lachssperma-DNA (Invitrogen) versetzt. Nach diesem Schritt können die Zellen in 50 μl Aliquots bei -80°C gelagert werden.
Für die Transformation wurden 50 μl der kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut, mit Plasmid-DNA (max. 2 μl/10 μl Zellen) versetzt und gemischt. Anschließend wurde das 6-fache Volumen einer sterilen LIT-PEG-Lösung zugefügt, gemischt und der Ansatz für 30 min bei 30°C inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 15 min bei 42°C wurden die Zellen in einer Heraeus Biofuge pico abzentrifugiert (3 min bei 2.000 Upm), einmal mit YEPDA-Medium gewaschen und in 100 μl TE-Puffer resuspendiert, bevor der Ansatz auf einer entsprechenden Selektionsplatte ausplattiert wurde.
Lit/PEG:
50 g PEG-3500
10 ml Lithium-Acetat-Lösung (100 mM) in 100 ml H2O, sterilfiltriert
SORB:
4.4.3 Transformation von U. maydis
Dieses Protokoll ist modifiziert nach Schulz et al., 1990 und Gillissen et al., 1992. Von einer auf Platte wachsenden Kultur wurde eine YEPSlight Flüssigkultur angesetzt und ü. N. bei 28°C geschüttelt. Diese Vorkultur wurde anschließend in 50 ml YEPSlight auf eine OD600 von 0,2 verdünnt und bei 28°C bis zu einer Zelldichte von OD600 = 0,8 - 1,0 geschüttelt. Nach Erreichen des optimalen Zelltiters wurden die Zellen durch Zentrifugieren (3500 Upm, 6 min, 4°C, Heraeus Biofuge Stratos) geerntet, einmal mit 25 ml SCS gewaschen und in 2 ml SCS mit 12,5 mg/ml „Lysing Enzyme“ (L1412, Sigma) resuspendiert. Die in diesem Puffer bei Raumtemperatur ablaufende Protoplastierung kann mikroskopisch verfolgt werden, da die zigarrenförmigen Zellen nach Lyse der Zellwand eine kugelige Form einnehmen. Nach der vollständigen Protoplastierung (5 - 15 min) wurden 10 ml SCS zugegeben und die
Protoplasten durch Zentrifugation bei 2.300 Upm (10min, 4°C, Heraeus Biofuge Stratos) pelletiert. Um das „Lysing Enzyme“ vollständig zu entfernen, wurde dieser Waschgang wiederholt. Anschließend wurde mit 10 ml STC gewaschen, und das Pellet danach in einem Volumen von 0,5 ml eiskaltem STC aufgenommen. Die so behandelten Protoplasten können 3 - 4 h auf Eis oder aliquotiert bei -80°C mehrere Monate aufbewahrt werden.
Zur Transformation wurden 100 μl Protoplasten mit 1 - 10 μl linearisierter Plasmid-DNA (3 - 5 μg) und 1 μl Heparin-Lösung (15 mg/ml) für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 500 μl STC/PEG folgte eine weitere Inkubation von 15 min auf Eis. Anschließend wurde der gesamte Transformationsansatz auf einer kurz zuvor mit Top-Agar überschichteten Regenerationsagarplatte ausgestrichen. Nach 4 bis 7 Tagen Inkubation bei 28°C wurden die gewachsenen Kolonien mit Zahnstochern auf antibiotikahaltigen CM-Platten vereinzelt.
SCS
Lösung 2 solange zu Lösung 1 geben bis ein pH-Wert von 5,8 erreicht ist und sterilfiltrieren.
STC
PEG in STC-Puffer lösen und sterilfiltrieren
4.4.4 Test auf filamentöses Wachstum
Eine Übernachtkultur der U. maydis Stämme in YEPSlight Flüssigmedium wurde auf eine OD600 = 0,2 in YEPSlight verdünnt bei 28°C und 180 Upm für 4 h inkubiert. Die Zellen wurden geerntet (3.500 Upm für 5 min bei RT) und das Pellet anschließend in YEPSlight
Flüssigmedium so aufgenommen, dass die Zelldichte bei etwa OD600 = 1,0 lag. Von jedem Ansatz wurden 3,5 μl auf eine PD-CC-Platte getropft. Die Platte wurde für 24 - 48 h bei RT oder 28°C unter Luftabschluss inkubiert.
4.4.5 Infektion von Zea mays mit U. maydis
Bei der hier verwendeten Methode handelt es sich um eine Spritzinfektion. Die Stämme wurden in YEPSlight Flüssigmedium bis zu einer OD600 = 0,8 angezogen und durch Zentrifugation (3.000 Upm, 5 min, RT, Heraeus Biofuge Stratos) geerntet. Anschließend wurden die Zellen in Wasser aufgenommen (OD600 = 1,0) und ca. 250 μl der entsprechenden Zellsuspension 1 cm über der Erde in das Innere des Blattwirbels von sieben Tage alten
Maispflanzen der Maisvarietät Early Golden Bantam injiziert. Die infizierten Pflanzen wurden für acht Tage in einer Klimakammer (GroBanks CLF Plant Climatics), inkubiert. Die Auswertung erfolgte nach modifizierten Kriterien aus Kämper et al., 2006.
Programm GroBanks: tagsüber 8:00 - 22:00, 28°C, Lichtstärke 250 μmol nachts 22:00 - 8:00, 22°C;
4.4.6 Induktion von ER-Stress in U. maydis
Für die Expressionsstudien wurde eine Übertagkultur in YNB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Stämmen angeimpft. Am Abend wurde die Zelldichte der Kulturen so eingestellt, dass die OD600 am nächsten Tag bei 0,3 liegt. Diese Kulturen wurden zur ER-Stressinduktion mit 3 mM DTT (für 3 h) oder 5 μ/ml Tunicamycin (für 4 h) behandelt und nach den entsprechenden Inkubationszeiten geerntet.
Zum Test auf das Zellwachstum wurde eine Übernachtkultur in YNB mit den entsprechenden Zellen angeimpft und am nächsten Tag die Zelldichte so eingestellt, dass die OD600 nach 4 h bei ca. 0,8 liegt. Die Zellen wurden anschließend 5 min bei 3.500 Upm abzentrifugiert und eine 10-fach Verdünnungsreihe beginnend bei OD600 = 1 hergestellt. 3,5 μl dieser Verdünnungsreihe wurden auf das entsprechende YNB-Festmedium (mit/ohne DTT oder Tunicamycin) getropft, und die Platten für zwei Tage bei 28°C inkubiert.