2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.3 Oligonukleotide
Die aufgeführten Oligonukleotide wurden mit wenigen Ausnahmen, die Bestandteil des Topoklonierungskits von Qiagen waren, von Metabion bezogen. Sie wurden auf eine Arbeitskonzentration von 10 pmol/µl (PCR), 1 pmol/µl (Sequenzierung) und 0,5 pmol/µl (RT-qPCR) mit Reinstwasser (Milli-Q) eingestellt.
Oligonukleotide zur Herstellung der Deletionskonstrukte
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘) ** + Spezifität
BamH_Tr1_for TCGAGGGGATCCGAGAGGTCGGTGCCCTCCT Stromaufwärts von pst1 (OE4485R-4471R) Pst_Tr1_rev CCCCGTCCTGCAGGTCTGAGTGCATCGCTTGG
Pst_Tr1_for GCGGACCTGCAGAACACCGAGTGATCAGAG Stromabwärts von pst1 (OE4485R-4471R) Hind_Tr1_rev GCGAAGGAAGCTTCCACGTCGTCATCGACG
BamH_Tr2_for GACTCGGGATCCAGGGCGAGCACGTCGAAG Stromaufwärts von pst2 (OE1679R-1674R) Pst_Tr2_rev ACGTGTCTGCAGTTCGGCGTCGTCTGCTGGC
Pst_Tr2_for AACGACCTGCAGCTGATCTACTAGCGACGG Stromabwärts von pst2 (OE1679R-1674R) Hind_Tr2_rev AGAGCAAAAGCTTTCCTCGCTGCCCCCCGA
Bam_ugp_for ACCTGCGGGATCCTCACAACTGACTGCGGT Stromaufwärts von ugp (OE5166F-OE5170F) Pst_ugp_rev GTGGTGGGCTGCAGCGGATAACGCAACTCG
Pst_upg_for CCGTCACTGCAGCTCGTGCACCCACCGAAC Stromabwärts von ugp (OE5166F-OE5170F) Hind_ugp_rev AGGGACTAAGCTTCGGCGGCAAGCGCAACT
Bam_2128_for CGCAGCGGGATCCGCGTCGTCGCTTCACCGCA Stromaufwärts von phoU4 (OE2128F)
Xba_2128_rev CCGTGTTCTAGAGCCGTACGCAAGTTCGTGCG
Xba_2128_for CACACTCTCTAGACCGACACCCCCCGGCCGCC Stromabwärts von phoU4 (OE2128F)
Hind_2128_rev TCGATGTAAGCTTCCTCCGATTTCTCCGCC
Oligonukleotide zur Herstellung der knockout-Konstrukte
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘)** + Spezifität
Xba_outpstS1_ for CACGTCTCTAGAGTCGACGGGCAGCCGATC Stromaufwärts von pstC1 (OE4483R)
NotI_outpstS1_rev TGCCGGCGGCCGCGGTTCACGTCTGGTAGTTC
Xba_outpstS2_ for CATCGTTCTAGAGGACCTGGACATCGACAG Stromaufwärts von pstC2 (OE1678R)
NotI_outpstS2_rev CAGTCAGCGGCCGCGTATACAGTCTTTGCT
Oligonukleotide zur Herstellung der Überexpressions-Konstrukte
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘)** + Spezifität
Pbop_for AGTGGAAGCTTGCGTGCACGCATCGACTT
bop-Promotor (243 bp) Pbop_rev AACTCCTGCAGGCAACAGTACCTAACGAGGA
phoU3_for TACGTCTGCAGATGGAACGACGGAAAGTC
phoU3-Gen (547 bp) phoU3_rev CAGTGGGATCCGGAAGATGCGTGACACGA
trh3_for ACAACACTGCAGATGGACGACATCGACCAG
trh3-Gen (407 bp) trh3_rev TCGACTGGATCCAGCTTCTCGTCGAGGATC
Oligonukleotide zur Herstellung der Promotorfusionskonstrukte Position 1-165 der verwendeten Promotorsequenz Ppst1 (5’-3’)* :
1 ATAGGTTCGG TTGGGGCGTC ACCTGGTTAA GTGTTCAGCC GGCTGACTGG 51 TGGTCTCACC AGTGATATAT AGCACACACA GTCCTATGGA GGGATGGCAG 101 CCACCACGTA GCCATATTAT AAACGGGTTT ACTGGTTCCG GGTGCCATTC 151 CAAGCGATGC ACTCA
Name Sequenz (5‘-3‘) ** + Position von
5‘-Ende; (Position der Punktmutationen) Ppst1_1 (for) TTTTTTGGATCCATAGGTTCGGTTGGGGCGTC 1
Ppst1_2 (rev) TTTTTTCTGCAGTGAGTGCATCGCTTGGAATGG 165 Ppst1_3 (for) TTTTTTGGATCCTCCTATGGAGGGATGGCAGCC 82 Ppst1_5 (for) TTTTTTGGATCCCCACGTAGCCATATTATAAACGGG 104 Ppst1_7 (for) TTTTTTGGATCCGTGATATATAGCACACACAGTCC 62
Ppst1_8 (for) TTTTTTGGATCCGTGATNNNNAGCACACACAGTCC 62; (67-70) Ppst1_11 (rev) TCCATAGGACTGTGTGTGCTNNNNATCACTGGTGAGACCACCAG 90; (67-70) Ppst1_12 (for) AGCACACACAGTCCTATGGAGGGATGGCAG 71
Ppst1_13 (rev) GCCATCCCTCCATAGGACTGNNNNTGCTATATATCACTGGTGAG 98 (75-78) Ppst1_14 (for) CAGTCCTATGGAGGGATGGCAGCCACCACG 79
Ppst1_15 (rev) TTTTTCTGCAGTGAGTGCATCGCTTGGAATGGCACCCGGAACCA GTAAACCCGTTTNNNNTATGGCTA
165 ; (117-120) Ppst1_16 (rev) TTTTTCTGCAGTGAGTGCATCGCTTGGAATGGCACCCGGAACCA
GNNNNCCCGTTTAT
165 ; (138-141) Ppst1_17 (rev) TTTTTTCTGCAGTGCCATCCCTCCATAGGACT 99
Position 1-237 der verwendeten Promotorsequenz Ppst2 (5’-3’)* :
1 ATGCGACCAC GTATCGATGC CTGTAATATA AATCCCGGTC ACGATACATA 51 GTTACTACAC CAAACCACTG TAGAGGAGAA TAAAGCGCTT GCAGGCGCTC 101 GGGTCGAAAT ATACATCGAC GACGAGCGTC GAATCGATTC GCGGACATGC 151 GATGTGAACT GTTCCCTATG TACTGCTATA TATACGTAAT AGCAGAGTAC 201 TTATTCGCAT CGCGGCGAGC ATACGACGAT GCCAGCA
Name Sequenz (5‘-3‘) ** + Position von
5‘-Ende; (Position der Punktmutationen) Ppst2_1 (for) TTTTTTGGATCCATGCGACCACGTATCGATGCC 1
Ppst2_2 (rev) TTTTTTCTGCAGTGCTGGCATCGTCGTATGCTC 237 Ppst2_3 (for) TTTTTTGGATCCCGGACATGCGATGTGAACTG 142 Ppst2_5 (for) TTTTTTGGATCCCCTATGTACTGCTATATATACGT 165
Ppst2_6 (for) TTTTTTGGATCCCCTATGTACTGCTANNNNTACGT 165; (179-182) Ppst2_7 (for) TTTTTTGGATCCCGTAATAGCAGAGTACTTATTCGC 185
Ppst2_8 (for) TTTTTTGGATCCCGAGCGTCGAATCGATTCGC 133 Ppst2_10 (rev) TTTTTTCTGCAGTGCTGGCATCGTCGTATGCTCGCCGCGAT
GCGANNNNGTACTCTGC
237; (201-204) Ppst2_11 (for) GATCCCGTAATAGCAGAGTACNNNNTCGCATCGCGGCGAGC
ATACGACGATGCCAGCACTGCA
195; (201-204) Ppst2_12 (rev) GTGCTGGCATCGTCGTATGCTCGCCGCGATGCGANNNNGTA
CTCTGCTATTACGG
237; (201-204)
Position 1-190 der verwendeten Promotorsequenz Pugp (5’-3’)* :
1 GAATCCAACA GCCACCCACA CAACGACTGG TTCGATATTA AAAACCGGGG 51 TCAGTTCTGG AACGTCGACG GTATTGCTGC GCGCCGCCCC ATGCACGGCT 101 CAATAGGTCT CCAGAACTGT CTGGACGGAT ATTTTCAACT CATATAAGCA 151 CTCATCCGAG GACCCCGAGT TGCGTTATCC GATGGCGCCC
Name Sequenz (5‘-3‘) ** + Position von
5‘-Ende Pugp_1 (for) TTTTTTGGATCCGAATCCAACAGCCACCCACAC 1 Pugp_2 (rev) TTTTTTCTGCAGGGGCGCCATCGGATAACGCA 190
Oligonukleotide zur PCR-Kontrolle, für Southernblot und Sequenzierung
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘) + Spezifität
pstS1_for GCGTCCGCCGCCGACGAGCTGCCGGACGCG
(Phosphatbindeprotein des ABC-Transporters Pst1) pstS1_rev GAACTCGCTCAACAGGAAGTTGATGAACGCG
4475_for GAAGGGCTGCAGTTTTCCGCGCGGCAGCCCTC
Gen OE4475R 4475_rev GCCCGTAAGCTTCGTCGATGACACACACGTC
pstS2_for GACGAGCTGCGGAGCATCTGGTCGGCCGAA
(Phosphatbindeprotein des ABC-Transporters Pst2) pstS2_rev CAGTCAGCGCGTCCAGTTGTTCTCGTTGGG
ugpB_for CTGGACTTCTGGCACGTTTTCGGCGACGAACT
Substratbindeprotein des ABC-Transporters Ugp
ugpB_rev CGGCCGTTGTCGTTGTTGACCAGGAGTTGG 2128_for GGGACGTGGCTCGCTGACTGTCACCC
Gen phoU4 (OE2128F) 2128_rev CTTCACGGCCTCCCCGCGCATCGTCG
RT_aph_3‟ GTCGCCTCGGTCGTCGTGATGAG
Gen aph (OE5192R) RT_aph_5‟ CCACGGCGTCCCCGGCTGC
5192-front5‟ GCGCGGATCCACGTGCAACAGGGTCACGATCC Stromaufwärts von aph (OE5192R)
5192-front3‟ GCGCCGCAGCGTGACTCTGTGGTGTGCGGTG check_Ppst1 GATGAACCCGGTCGCTCCCG
Promotor des pst1-, pst2- und ugp-Operons
pReport-Vektor
(zur Kontrolle der Promotor-fusions-Transformanten) check_Ppst2 AGCCGCCGGTGACCTGGACT
check_Pugp CCGCCGAAACGATGCACACG check_3349 CCGTGTTCGAGGCCGGATCGCTGT check_bgaH ATTCGTCGCCACGCCAACTC check_MevR CTTCATCGACGCCCACACGCACCT T3_forward ATTAACCCTCACTAAAGGGA
Oligonukleotide von Invitrogen zur Sequenzierung des Vektors pCR®4-TOPO®
T7_reverse TAATACGACTCACTATAGGG M13_forward CAGGAAACAGCTATGAC M13_reverse GTAAAACGACGGCCAG
pVT_for TTTATCTCGGCCGGAGGTCCTAC
Oligonukleotide zur
Sequenzierung des Vektors pVT pVT_rev1/rev2 GGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG/
GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA AGTGGGCCAACGAGTACGACACGGA
Transporters Pst2 Pbop_for AGTGGAAGCTTGCGTGCACGCATCGACTT bop-Promotor
check_phoU3_rev CGCGACAAGCTTCAGGAGGTGGTTGCCGACGTA Region stromabwärts des phoU3-Gens
check_trh3_rev: GATCACGTCCTGCGTGGCGTTTTCG Region stromabwärts des trh3-Gens
Oligonukleotide für die reverse Transkription und anschließende PCR (RT-PCR)
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘) + Spezifität
RT_pst1_1 TCAGCTTGAACTCCTCCAGC für cDNA-Synthese
RT_pst2_1 CGTTGTCGACCATGTACACC für cDNA-Synthese
phoX1_for GCGTCCGCCGCCGACGAGCTGCCGGACGCG für PCR-Fragment pst1_A (560 bp)
phoX1_rev GAACTCGCTCAACAGGAAGTTGATGAACGCG
phoX1_FOR CTACGGGGAGAACCTGGGCGCCGAGGAGTA für PCR-Fragment pst1_B (510 bp)
pstC1_REV CGGTGGCGGCCTGCTCGCGTCGCCACCCCA
pstC1_for GCGCGCGAGTACCGCTCCCGGACCGGTG für PCR-Fragment pst1_C (1090 bp)
pstA1_REV CGACTCCCCGGTGGCCAGTTGGGTCTTCGT
pstC1_FOR CGTGACCGTGATGGCGTTGAGCGTCGGGTC für PCR-Fragment pst1_D (800 bp)
pstB1_REV GGCTCCCGAACGGTCGTCGCTGCGTCGTG
pstA1_FOR CGGTCGGCATCGCCAGCCGTCGGTACTTCA für PCR-Fragment pst1_E (880 bp)
pstB1_rev GCGATACAGAGGCGCTGCTGTTGGCCCCCG
pstB1_for GTCAGCGTGTCCGACCTGGATACGTACTAC für PCR-Fragment pst1_F (1730 bp)
4476_REV ACCCCGGCAGCGACACCGTGTACGTGC
OE4476_for TGCGGTGCGGCCATCGCTGC für PCR-Fragment pst1_G (420 bp)
OE4471_rev TGCCGCTGCCAGTGGGTGCC
phoX2_for GACGAGCTGCGGAGCATCTGGTCGGCCGAA für PCR-Fragment pst2_A (550 bp)
phoX2_rev CAGTCAGCGCGTCCAGTTGTTCTCGTTGGG
phoX2_for GACGAGCTGCGGAGCATCTGGTCGGCCGAA für PCR-Fragment pst2_B (680 bp)
pstC2_rev GATGGCGCGCGACAGCGCCAGGATGAAC
pstC2_for CGTTCTCTGCGCCGCTGGTCGGCGTCGAC für PCR-Fragment pst2_C (1300 bp)
pstA2_REV GGGCCGGGCAGACCGAACAGCGAGAGAT
pstA2_for CGACCGTGATCGTGGGGTCGCTGGTCGGTG für PCR-Fragment pst2_D (1250 bp)
pstB2_REV CGCCCTCGACGTCCTGGATTTCGAGGCCGT
pstB2_FOR AGCACCAGCGCGTCGAAGAGTATATCACTG für PCR-Fragment pst2_E (580 bp)
phoU_rev GGCGGCGTCGATCTCGGTCTCGATCAGATC
Oligonukleotide für 5’-RACE
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘) + Spezifität
GSP1_pst1 TCGTCACGAACTTCTCCTGG für cDNA-Synthese
GSP2_pst1 CTCGATCCCTCGTTGGTGATCGGGAACACCG für PCR mit AAP
GSP1_pst2 TCGATGGCCTCAGTCAGCGC für cDNA-Synthese
GSP2_pst2 GTGCAGAAGTGGTTGGCGAACCCG für PCR mit AAP
GSP1_ugp TGTTGTAGAGCATGATGGTG für cDNA-Synthese
GSP2_ugp TCTCGAAGAGTTGGACGATCCCCGG für PCR mit AAP
GSP1_bgaH GTCGTTTGCTTCGCGGATGA für cDNA-Synthese
GSP2_bgaH TGAGTTGAAACAGGTGAACCGACGG für PCR mit AAP
(oder AUAP) AAP GGCCACGCGTCGACTACGGGIIGGGIIGGGIIG für PCR mit GSP2
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC (Sequenzangabe von Invitrogen)
für PCR mit GSP2
Oligonukleotide für RT-qPCR
Bezeichnung Sequenz (5‘-3‘) + Spezifität
phoX1_qRT_for CAGCCGTGAGATCGTTGACA
Gen pstS1 (pst1-Operon) phoX1_qRT_rev CCGACCAGTTCGTGATCTCC
pstC1_qRT_for AAGGCGGTGACGTTTCTGAT
Gen pstC1 (pst1-Operon) pstC1_qRT_rev CGCACGAGTAAGAACGCAAC
phoX2_qRT_for GAACAGTGGTCCGACGTGAA
Gen pstS2 (pst2-Operon) phoX1_qRT_rev GTAGTCGTAGGTGCCCGAGG
pstC2_qRT_for GGGCATCGTGGAGTTCCTTA
Gen pstC2 (pst2-Operon) pstC2_qRT_rev GATCATCACCATCAGCGTCG
ugpA_qRT_for CCTCTACTATCCGGGCCTCG
Gen ugpA (ugp-Operon) ugpA_qRT_rev TTGAGGTCAGCAGCTGAACG
ugpB_qRT_for TCACTCGTGGATGCAGATCG
Gen ugpB (ugp-Operon) ugpB_qRT_rev AAGTTAGTCTCCGTGGGTCGG
aph_qRT_for TGTTCAGCCAGGAGAGCCAC
Gen aph aph_qRT_rev AGGTTGGGTTGTGTGTTCTCG
phoU3_qRT_for GCGGCTCCCTCCTGTTGACCCCCATCG
Gen phoU3 phoU3_qRT_rev CTTCGAGCATGGAGACCGCGATGAGGTGC
trh3_qRT_for GAACGTCAAGGCGATGATCG
Gen trh3 trh3_qRT_rev CTGCCACACGAAGTCGACGG
fdx_qRT_for GAGTACATCCTCGAAGCCGC
Gen fdx (interner Standard) fdx_qRT_rev TGAGGATCTGCTGCATGTCC
*Startcodon ist unterstrichen und durch Fettdruck hervorgehoben
**Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind unterstrichen, eingeführte Punktmutationen sind mit N dargestellt. Die Identität des mutierten Nukleotids der jeweiligen Transformante ist im Ergebnisteil in Kapitel 3.1.4.5 angegeben.
+Die Schmelztemperatur TMwurde für Primer mit einer Länge von 14 – 49 Basen näherungsweise folgendermaßen berechnet:
TM = 100.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (820/(wA+xT+yG+zC)) + 16.6*log10([Na+])