Die Promotorstruktur der Operons pst1 und pst2

4.3.2.1 TATA-Box

Das bgaH-Reportersystem wurde in erster Linie dazu eingesetzt, um cis-aktive Elemente in den pst1- und pst2-Promotoren zu identifizieren. Dabei wurde zunächst die Lage der TATA-Boxen bestimmt. Das Zentrum der TATA-Box des pst2-Promotors und der beiden TATA-Boxen der Transkriptionsstarts TSS-1 und TSS-2 des pst1-Promotors liegen etwa in dem von (Brenneis et al., 2007) beschriebenen Abstand (-27/-28) zum jeweiligen Transkriptionsstart. Punktmutationen in diesen Bereichen führten zu einem totalen Ausfall der BgaH-Aktivität im ONPG-Enzymtest. Northernblot-Analysen (Abb. 34) zeigten, dass die mRNA-Menge durch Punktmutationen in der TATA-1-Box des pst1-Promotors unter Phosphatmangel stark zurückgeht. Das Ergebnis zeigt, dass die Synthese des leader-losen Transkripts unter –Pi-Bedingungen durch die Mutation der TATA-1-Box gestört wird. Unter phosphatgesättigten Bedingungen hat dieselbe Mutation nur eine geringe Auswirkung, da hier hauptsächlich das Transkript mit leader-Sequenz entsteht. Auch bei Punktmutationen in der TATA-2-Box nehmen die mRNA-Mengen je nach Punktmutation mehr oder weniger stark ab. Die Mutation der TATA-2-Box wirkt sich stärker auf das Transkript mit leader-Sequenz unter phosphatgesättigten Bedingungen aus, jedoch scheint auch die Synthese des leader-losen Transkripts beeinflusst zu werden. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die TATA-2-Box auch unter Phosphatmangel an der Transkription ausgehend von TSS-1 beteiligt ist.

Die BgaH-Aktivität, welche die Genexpression widerspiegelt, nimmt in den drei TATA-2-Box-Mutanten verglichen mit dem Wildtyp unter –Pi-Bedingungen etwa um die Hälfte bis hin zum 36-fachen ab (Abb. 34). Auf die Rolle der TATA-2-Box im pst1-Promotor wird später noch weiter eingegangen.

Die Analyse der Transformanten in denen der pst1-Promotorbereich schrittweise deletiert wurde, zeigt, dass die Region zwischen 101 bp und 74 bp stromaufwärts von TSS-1 ein für die phosphatabhängige Promotoraktivität wichtiger Bereich ist. Die TATA-2- bzw. die zweite P-Box liegt in diesem Bereich.

Die Analyse der Transformante mit einer Deletion des 3„-Endes des pst1-Promotors bis zum TSS-2 zeigt, dass dieser Bereich unter +P_i–Bedingungen für die Transkription ausreicht, da die mRNA-Mengen dieser Mutante im Northernblot gleich groß waren wie im Wildtyp. Aus

wird unter –P_i-Bedingungen, unter denen die Transkription nur am TSS-1 initiiert, fast kein Transkript und dementsprechend auch fast kein Translationsprodukt gebildet.

Eine Mutation in gleichzeitig beiden TATA-Boxen des pst1-Promotors könnte die Transkription unter phosphatgesättigten Bedingungen ganz ausschalten und zusätzlich bestätigen, dass die TATA-2-Box die TATA-Box des TSS-2 ist. Solange jedoch die Transkription von TSS-1 noch erfolgen kann, ist auch ein Transkript unter +Pi-Bedingungen zu sehen.

Die Transkriptionsstartbestimmung einer Transformante mit mutierter TATA-2-Box zeigte keine Transkripte mehr, die von TSS-2 initiiert wurden. Die Transkription konnte nur noch von TSS-1 erfolgen. Dies beweist, dass TATA-2 die zum Transkriptionsstart bei –59 bp (TSS-2) zugehörige TATA-Box ist.

4.3.2.2 P-Box – eine AT-reiche Sequenz

Die basale archaeale Transkriptionsmaschinerie ist eine vereinfachte Version des eukaryotischen Typus, ihre Aktivität wird jedoch häufiger von Bakterien-ähnlichen Faktoren kontrolliert (Bell et al., 1999). Die Regulation vieler bakterieller Gene verläuft über Zweikomponentensysteme. Sämtliche bisher untersuchten bakteriellen PHO-Regulons werden von einem Zweikomponentensystem kontrolliert (Vershinina & Znamenskaia, 2002).

H. salinarum besitzt zwar zu Bakterien homologe Gene mehrerer Histidinkinasen und Antwortregulatoren, jedoch fehlt ein Operon des klassischen PHO-Regulon-Zweikomponentensystems. Zudem wurde die Regulation über eines der vorhandenen Zweikomponentensysteme ausgeschlossen (Wende et al., 2009).

Daraus folgt, dass das Vorhandensein einer klassischen PHO-Box, wie sie in Bakterien vorkommt, in der Promotorregion von pst1 und pst2 unwahrscheinlich ist.

Ein cis-aktives Element, das allein für die phosphatabhängige Promotoraktivität von pst1 und pst2 in H. salinarum verantwortlich ist, konnte nicht gefunden werden. Es konnte jedoch eine Sequenz identifiziert werden, die für die phosphatabhängige Promotoraktivität essentiell ist, und der die Bezeichnung P-Box gegeben wurde. Die P-Box stellt einen AT-reichen Bereich stromaufwärts der TATA-Box des pst2-Promotors und der TATA-1-Box des pst1-Promotors dar.

Punktmutationen im Bereich -36 bis -39 im pst1-Pomotor und -46 bis -49 im pst2-Promotor führten zu einem unterschiedlich starken Verlust der Promotoraktivität sowohl unter +P_i– als auch unter –P_i-Bedingungen. Die zum zweiten Transkriptionsstart bei -59 bp (TSS-2)

die Funktion einer TBP-Bindestelle, da nur unter diesen Bedingungen vom TSS-2 transkribiert wird. Unter phosphatlimitierten Bedingungen scheint die TATA-2-Box die Funktion einer zweiten P-Box zu übernehmen, da die pst1-Promotoraktivität bei Mutation in diesem Bereich stark beeinträchtigt wird. Somit wird vor allem die phosphatabhängige Promotoraktivität des pst1-Promotors durch die zweite P-Box-Sequenz beeinflusst, da diese Sequenz auch die Transkription von TSS-1 reguliert und somit nur an der phosphatabhängigen Promotoraktivität beteiligt ist. Besonders effektive Punktmutationen in der zweiten P-Box enthielten ein Guanin an erster Stelle sowie mehrere Guanine und Cytosine (siehe Abb. 31). Diese Mutationen führten zu einem totalen Ausfall der Promotoraktivität. Punktmutationen, die noch Adenin und Thymin enthielten, konnten die Aktivität reduzieren, jedoch nicht ausschalten.

Ein Vergleich der Sequenzen der P-Boxen führt zu der Konsensussequenz ATATWWW²⁰. Auch der ugp-Promotor enthält bei -46 bis -52 eine zum Konsensus passende P-Box, die jedoch experimentell nicht untersucht wurde (siehe Abb. 14).

Die TATA-2-Box könnte eine P-Box sein, da sie unter –P_i-Bedingungen die Menge der mRNA und die Intensität der Genexpression beeinflusst. Dies wurde zum einen durch eine Northernblot-Analyse bestätigt, in der die Mutation der TATA-2-Box zu einer niedrigeren mRNA-Menge führte. Zum anderen wurde die im ONPG-Enzymtest gemessene BgaH-Aktivität je nach Punktmutation unterschiedlich stark verringert (siehe Abb. 34). Die mRNA-Menge und BgaH-Aktivität erscheinen dabei entgegengesetzt beeinflusst zu werden.

Beispielsweise war bei der Transformante KF1A2mut3 die mRNA-Menge hoch, jedoch die BgaH-Aktivität stark verringert (siehe Abb. 34). Dies könnte darauf hindeuten, dass die synthetisierten Transkripte der TATA-2-Box-Mutante nicht mehr translatiert werden können.

AT-reiche Regionen stellen Bindungssequenzen für diverse Regulatoren, TBP oder die RNA-Polymerase dar. Aus Bakterien ist ein AT-Basenpaar-reiches sogenanntes UP-Element stromaufwärts der −35-Region bekannt, das durch Anbindung an die α-Untereinheit der RNA-Polymerase und / oder räumlicher Annäherung zur Promotorregion durch Krümmung der DNA zu einer Verstärkung der Promotoraktivität führt (Aiyar et al., 1998, Estrem et al., 1998, Ross et al., 1998). Ein Beispiel aus Eukaryoten sind AT-reiche Regionen in Promotoren von Genen des PHO-Regulons in S. cerevisiae, die neben zwei UAS (upstream activator sequence) liegen und von einigen Transkriptionsfaktoren zusammen mit Pho2p gebunden werden (Barbaric et al., 1996, Magbanua et al., 1997a).

Es wäre möglich, dass die AT-reiche Region in H. salinarum analog zu der von S. cerevisiae an eine bisher unbekannte UAS angrenzt oder selbst eine UAS darstellt.

Die stromaufwärts der TATA-1-Box liegende P-Box des pst1-Operons grenzt an das BRE-Element. Zwischen der TATA-1-Box und der P-Box liegen 7 Nukleotide, die vermutlich das BRE-Element darstellen. Das BRE-Element ist eine Purin-reiche Sequenz. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass das Ende der P-Box ein Teil des BRE-Elements ist.

Es wurde in dieser Arbeit jedoch vermutet, dass das purinreiche BRE-Element stromabwärts der P-Box liegt.

Eine genauere Promotoranalyse würde zeigen in welchem Bereich das BRE-Element liegt, falls die Grenzen nicht fließend sind.

Einige Promotoren benutzen auch zwei TATA-Boxen für einen Transkriptionsstart, wie aus der Hefe (Iyer & Struhl, 1995, Li & Sherman, 1991) und dem Menschen (Santra et al., 1994) bekannt ist. Die AT-reiche P-Box in H. salinarum könnte auch eine solche zweite TATA-Box darstellen.