In silico Analyse der Promotorsequenzen pst1, pst2 und ugp

Die gesamte Promotorregion der Operons pst1, pst2 und ugp erstreckt sich über den nicht-kodierenden Bereich zwischen den Leserahmen der Gene pstS1, pstS2 bzw. ugpB und den Leserahmen der stromaufwärts davon liegenden Gene, welche in allen drei Fällen in die entgegengesetzte Richtung orientiert sind. Diese Bereiche haben eine Länge von 155 bp, 227 bp bzw. 180 bp (siehe Abb. 13). Die Sequenzen des gesamten Promotorbereichs pst1, pst2 und ugp können im Anhang in Abb. 53 eingesehen werden.

Die Analyse der genannten Promotorbereiche ist in Abb. 14 gezeigt und umfasst cis-aktive Elemente mit Konsensussequenzen die in (Brenneis et al., 2007) beschrieben wurden.

Abb. 14: Putative cis-aktive Elemente der Promotoren des pst1-, pst2- und ugp-Operons: Ppst1, Ppst2 und Pugp.

Die gezeigte Länge aller Promotorsequenzen beträgt 105 bp. Farbige Kästen zeigen putative Sequenzen der cis-aktiven Elemente: -10/-11-Region ist weiß, TATA-Box ist grau, BRE ist orange, AT-reiche Regionen (P-Boxen) grün und eine CA-reiche Region (RY-Box) gelb hinterlegt. Die bestimmten Transkriptionsstarts (TSS) sind blau hinterlegt und die Startcodons kursiv dargestellt.

Die TATA-Box oder das BRE-Element sind basale Promotorelemente, die vom TATA-Box-Bindeprotein (TBP) oder dem Transkriptionsfaktor B (TFB) gebunden bzw.

erkannt werden. Der Konsensus für die TATA-Box ist TTWT⁴ mit dem Zentrum bei -27/-28, für das stromaufwärts davon liegende BRE-Element ist er CGAAA. Zwei frühere Studien

beschränken sich für das BRE-Element auf den Konsensus AA (Slupska et al., 2001, Soppa, 1999). Ein neu entdecktes Element mit dem Konsensus WW¹ befindet sich bei -10/-11.

Der Transkriptionsstart aller drei Operons befindet sich 1 bp stromaufwärts des Startcodons ATG (siehe 3.1.3).

Nur der ugp-Promotor zeigt ein -10/-11-Element, das dem Konsensus folgt.

Ein mögliches TATA-Box Motiv liegt etwa 23-28 bp stromaufwärts des jeweiligen Transkriptionsstarts (TSS). Für das pst1-Operon könnte das Kernmotiv der TATA-Box TTTA, für das pst2-Operon TTAT und für das ugp-Operon TCAT sein. Das ugp-Operon besitzt in der Region -20 bis -30 nur vier Basen, die auf ein mögliches TATA-Box Motiv hinweisen. Ein bekanntes Beispiel für ein schlechtes TATA-Box Motiv in H. salinarum stellt beispielsweise die TATA-Box des bop-Promotors dar (Baliga & DasSarma, 2000). Ein besseres TATA-Box Motiv wäre beim ugp-Promotor zwischen 34 - 39 bp zu finden.

Ein weiterer in dieser Arbeit bestimmter Transkriptionsstart (TSS-2) des pst1-Operons befindet sich 60 bp stromaufwärts des Startcodons. Die dazugehörige putative TATA-Box liegt 26 - 32 bp stromaufwärts des TSS-2.

Das Motiv gleicht zudem einer alternierenden AT-reichen Region, die beim selben Promotor bei 36 - 42 bp, beim pst2-Promotor bei 44 - 50 bp und beim ugp-Promotor bei 46 - 52 bp stromaufwärts des TSS liegt. Bei allen drei Promotoren ist ein AT-reicher Bereich zwischen etwa 36 - 52 bp zu beobachten. AT-reiche Sequenzbereiche können beispielsweise Bindestellen für Proteine mit einer Homeodomäne darstellen. Diese Domäne ist in vielen Transkriptionsfaktoren zu finden und wird auch als helix-turn-helix (HTH) bezeichnet. Der Basen-spezifische Kontakt findet in der großen Furche der DNA statt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bindet Pho2p, ein Transkriptionsfaktor des PHO-Regulons mit einer Homeodomäne, an AT-reiche Sequenzen (Barbaric et al., 1996, Magbanua et al., 1997a). Diese befinden sich neben UAS (upstream activator sequence), die von anderen Transkriptionsfaktoren zusammen mit Pho2p gebunden werden (Magbanua et al., 1997a, Magbanua et al., 1997b). Die AT-reiche Region in H. salinarum könnte analog zu der von S. cerevisiae an eine UAS angrenzen oder selbst eine UAS darstellen.

Die Promotorbereiche der Gene des PHO-Regulon in Bakterien, wie beispielsweise E. coli oder B. subtilis, zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine oder mehrere sogenannte PHO-Boxen besitzen. In der Einleitung wurde bereits näher auf diese PHO-Boxen eingegangen. Die PHO-Box aus E. coli besteht aus zwei 7 bp langen direkten

Wiederholungen (direct repeats) des Konsensus CTGTHAY⁵, die durch 4 Basen (AWAW²) voneinander getrennt sind. Vor einigen Genen oder Operons, z.B. dem pst-Operon, von E. coli liegt der 18 bp lange Bereich in weiteren Kopien vor (Makino et al., 1994). Im Promotorbereich des pst2-Operons von H. salinarum konnte eine Struktur gefunden werden, die der Konsensussequenz der PHO-Box aus E. coli gleicht (siehe Tab. 3).

Tab. 3:Vergleich der PHO-Box ähnlichen Struktur in der Promotorregion des pst2-Operons von H. salinarum und der PHO-Box des pst-Operons in E. coli.

Identische Basen sind durch Fettdruck hervorgehoben.

7 bp 4 bp 7 bp

Konsensus^*2 CTGTCAT AWAW CTGTWAY

E. coli (pst-Operon, PHO-Box1) CTGTCAT AAAA CTGTCAT E. coli (pst-Operon, PHO-Box2) CTTACAT ATAA CTGTCAC

H. salinarum (pst2-Operon) CTGCTAT ATAT ACGTAAT

*Konsensus nach Wanner (1993)

Weder im Promotorbereich des pst1- noch des ugp-Operons konnte ein dem PHO-Box-Konsensus ähnlicher Bereich identifiziert werden. Die in Tab. 3 gezeigte Sequenz des pst2-Promotors liegt innerhalb der AT-reichen Region (-55 bis -37). Die einzige Homologie zu dem pst1- und ugp-Promotor in diesem Bereich zeichnet sich durch die AT-reiche Struktur aus.

In dieser Arbeit wurde für die AT-reiche Region der Begriff P-Box eingeführt, der sich speziell auf die AT-reiche Struktur in H. salinarum bezieht. Der alternative Begriff P-Box wird verwendet, da außer im pst2-Promotor keine Homologie zu PHO-Boxen anderer Organismen gefunden werden konnte. Außerdem ist die Regulation des PHO-Stimulons durch ein Zweikomponentensystem in H. salinarum ungewiss, der Regulationsmechanismus somit noch unbekannt. Die PHO-Box wird in Bakterien von einem Antwortregulator erkannt und gebunden. Aus einer vorangegangenen Arbeit ging hervor, dass für H. salinarum ein klassisches Zweikomponentensystem ausgeschlossen werden kann (Wende et al., 2009).

Daraus folgt, dass auch keine klassische PHO-Box in der Promotorregion vorliegt. Auf essentielle cis-aktive Elemente in H. salinarum wird in Kapitel 4.3 noch ausführlicher eingegangen.

Ein Homologievergleich der Promotorregionen stromaufwärts der ersten Gene der pst-Gencluster von vier verschiedenen archaealen halophilen Organismen (Halobacterium salinarum, Haloquadratum walsbyi, Natronomonas pharaonis und Haloarcula marismortui) zeigt, dass sowohl die TATA-Box als auch die AT-reichen Regionen konserviert sind (siehe Abb. 15).

Abb. 15: Homologievergleich der Promotorregion des ersten Gens der pst-Gencluster von Halobacterium salinarum (H.s.), Haloquadratum walsbyi (H.w.), Natronomonas pharaonis (N.p.) und Haloarcula marismortui (H.m.).

Die verschiedenen Promotoren zeigen eine hohe Homologie im Bereich der TATA-Box, die etwa 25 bp stromaufwärts des Startcodons liegt. Alle Promotoren zeigen zudem AT-reiche Regionen stromaufwärts der TATA-Box, die in dieser Arbeit auch als P-Boxen bezeichnet werden. Die entsprechenden Gene der Promotoren sind in Klammern angegeben. Der Transkriptionsstart des pst1- und pst2-Operons (pstS₁ = OE4485R und pstS2 = OE1679R) aus H. salinarum ist mit einem schwarten Pfeil markiert, der TSS-2 des pst1-Operons bei 47 mit einem roten Pfeil. Die TATA-2-Box des pst1-Operons ist rot umrahmt.

Das BRE-Element, welches stromaufwärts der TATA-Box liegt, weicht von dem vorgegebenen Konsensus CGAAA ab und nur beim pst1- und ugp-Promotor kann der Konsensus AA gefunden werden (Abb. 14).

Bei 76 - 83 bp stromaufwärts des TSS weist der pst1-Promotor einen alternierenden RY⁶ -Sequenzbereich (CACACACA) auf, der als RY-Box bezeichnet wird. Diese wurde auch im bop-Promotor im selben Abstand zum Transkriptionsstart wie beim pst1-Promotor beschrieben. Es wurde vermutet, dass diese Sequenz, die zur Supercoil-Konformation neigt, an der Regulation der Transkription beteiligt sein könnte indem sie eine Z-DNA-Struktur

Um die Rolle der cis-aktiven Elemente für die Aktivität der Promotoren bestätigen zu können, wurden die Sequenzen offensichtlicher Motive im Folgenden durch Punktmutation verändert und die BgaH-Aktivität mit der der nativen Sequenz verglichen (siehe dazu Kapitel 3.1.4.5).

3.1.4.2 Herstellung verschiedener pst1-, pst2- und