4.2 CHEMISCHE E PILEPSIE -M ODELLE BEI MÄUSEN
4.2.2 G ENOTYPISIERUNG
Zur Aufarbeitung der DNA eignen sich unterschiedliche Gewebe der Mäuse, wie z.B. die Schwanzspitze. Von jedem Tier wurde das 0,5 bis 1 cm lange Ende des Schwanzes mit einer autoklavierten Schere entfernt und in einem autoklavierten Eppendorf-Tube bis zur weiteren Bearbeitung bei -20 °C gelagert. Zwischen den Probenahmen wurde die Schere mit 70%iger Ethanollösung gereinigt, um ein Überführen von Fremd-DNA zu vermeiden.
Die Wunden der Tiere wurden mit Ethacridinlactat (Rivanol®) behandelt.
Für die DNA-Präparation wurde das DNeasy®Tissue Kit (Quiagen, Hilden) bzw. das E.Z.N.A. Tissue DNA Mini Kit® (peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Angabe der Hersteller. Die Lagerung der gelösten DNA erfolgte bei -20 °C.
Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) ist eine schnelle und effiziente Methode für die in vitro-Amplifikation eines definierten DNA-Abschnittes.
Das Prinzip wurde erstmals von SAIKI et al. (1985) beschrieben. Dabei werden zwei Oligonukleotide mit bekannter Sequenz als Primer verwendet, welche den Bereich der zu amplifizierenden DNA flankieren und komplementär zu den Sequenzen der gegenüberliegenden DNA-Einzelstränge sind. Bei der hier verwendeten allelspezifischen Amplifikation wurden 3 Primer verwendet. Dabei sind zwei Primer spezifisch für den Genotyp der Mäuse. Diese beiden Primer liegen genau an dem DNA-Bereich, der das ausgeknockte Gen enthält, in 5´→3´-Richtung. Einer dieser Primer ist komplementär zur Wildtypsequenz, während der zweite Primer komplementär zu der anstelle des eigentlichen Genes eingefügten DNA-Kassette ist. Ein weiterer Primer stellt den Reverse-Primer dar. Die Sequenzen der hier verwendeten Reverse-Primer (Roth, Karlsruhe) finden sich in Tab. 4.
Das Reaktionsprinzip der PCR beruht auf der Wiederholung von drei Reaktionsschritten in mehreren Zyklen, die durch ein Enzym, die Taq-Polymerase, katalysiert werden. Beim ersten Reaktionsschritt, der Denaturierung, werden die beiden Doppelstränge des DNA-Moleküls voneinander getrennt. Während des Annealingschrittes lagern sich die Primer an die komplementären Stellen der Einzelstränge der DNA an. An diese kurzen DNA-Segmente bindet die Polymerase. Bei der Elongation erfolgt ausgehend vom 3´-Ende jeden Primers die DNA-Neusynthese entlang des DNA-Stranges in 5´→3´-Richtung. Die während eines Zyklus entstandenen DNA-Kopien entsprechen den primerbegrenzten DNA-Abschnitten und dienen ihrerseits im folgenden Zyklus als Matrize, so dass eine exponentielle Amplifikation erfolgt.
Name Primer-Sequenz Primerlänge
NCAM 1 5´> CTG CCA CAG ATA GTG
ACC CAG TGC <3´ 24 Basen
NCAM 2 5´> CGG AGA ACC TGC GTG
CAA TCC ATC <3´ 24 Basen
NCAM 3 5´> TTG GAG GCA GGG AGC
TGA CCA CAT <3´ 24 Basen
PSTkoLW-13 5´> CTC AGT TCT GGC TAT
TTC TTT TGT <3´ 24 Basen
PSTkoLW-14 5´> GAG CTC ACA ACG ACT
CTC CGA GC <3´ 23 Basen
PSTko LW-18 5´> ACC GCG AGG CGG TTT
TCT CCG GC <3´ 23 Basen
Tab. 4: Primer für die Genotypisierung des NCAM- und des ST8SiaIV-Gens von Mäusen.
Die PCR-Ansätze wurden in einem Gesamtvolumen von 30 µl durchgeführt und enthielten folgende Komponenten (PCR-Zubehör von peqLab Biotechnologie, Erlangen oder von InvitroGen, Karlsruhe):
10x PCR-Puffer 3 μl dNTP (je dNTP 20mM) 0,3 μl
MgCl2 0,9 μl
Primer (je Primer 10 μM) 1,8 μl Taq Polymerase (5U/ μl) 0,2 μl Bidest 21,8 μl
Proben-DNA 2 µl
Die Amplifikation der PCR erfolgte für Proben von Tieren mit genetischer Defizienz von NCAM im T-Personal Cycler (Biometra, Göttingen) unter folgenden Bedingungen:
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 45 sec
Annealing 60 °C 90 sec 30 Zyklen
Extension 72 °C 90 sec
Extension 72 °C 7 min
Für Mäuse mit einer genetischen Defizienz von ST8SiaIV wurde die PCR-Amplifikation unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 1 min
Annealing 56 °C 1 min 35 Zyklen
Extension 72 °C 2 min
Extension 72 °C 7 min
Zur Auftrennung der DNA-Fragmente dienten Agarosegele mit einer Konzentration von 1,5%. Dazu wurde die erforderliche Menge Agarose (peqGOLD Universal Agarose, peqLab Biotechnologie GmbG, Erlangen) unter Aufkochen in 0,5x TBE-Puffer gelöst. Nach dem Zusetzen von Ethidiumbromid (0,05 µl/ml) wurde die Lösung erneut aufgekocht und nach leichter Abkühlung in die Gelkammer gegossen. Die Elektrophorese erfolgte unter einer Spannung von ca. 6V/cm Gellänge. Die Analyse und fotographische Dokumentation der aufgetrennten DNA-Fragmente erfolgte unter UV-Licht (302 nm). Eine Abschätzung der Fragmentgröße war anhand eines Molekulargewichtsstandards (peqLab Biotechnologie, Erlangen) möglich.
Schädeldecke
Paladur®-Aufbau Hamilton-Spritzen Aqua dest.
Thionin-Lösung
Testsubstanz
Führungskanülen Injektionskanülen
Luftblasen 4.3 MIKROINJEKTIONSTECHNIK
Die Mikroinjektionen wurden mit einer 2 µl Hamilton-Spritze (Firma Sigma Aldrich Chemie GmbH, München) durchgeführt. Diese wurde mit einem 33 cm langen Polyethylenschlauch (FEP-Tubing, Axel Semrau GmbH, Sprockhöfel) mit einem Innendurchmesser von 0,12 mm über ein Verbindungsstück aus 0,2 mm dickem Polyethylenschlauch befestigt. Ein weiteres identisches Verbindungsstück befestigte die Injektionskanüle mit dem FEP-Schlauch.
Zu Beginn wurde destilliertes Wasser mit einer 1 mm Injektionsspritze in den FEP-Schlauch aufgezogen, so dass der FEP-Schlauch zu einem Viertel gefüllt war. Daraufhin wurden eine winzige Luftblase (1-2 mm Schlauchstrecke) und anschließend eine Thioninlösung (2-3 cm Schlauchstrecke) aufgezogen. Anschließend wurde wieder eine Luftblase (1-2 mm Schlauchstrecke) und erneut destilliertes Wasser (2-3 cm Schlauchstrecke) aufgenommen. Nach einer weiteren Luftblase wurde letztlich die Injektionslösung aufgezogen, bis der FEP-Schlauch vollständig gefüllt war. (⇒ dest.
Wasser – Luftblase – Thioninlösung – Luftblase – dest. Wasser – Luftblase – Injektionslösung). Die 1 mm Injektionsspritze wurde nun gegen die Hamilton-Spritze ersetzt und an das freie Ende des Schlauches die Injektionskanüle (14 mm Länge)
Abb. 3: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Durchführung von Mikroinjektionen.
angebracht. Der Aufbau ist in Abb. 3 dargestellt. Mit der farbigen Thioninlösung kann aufgrund dieser Konstruktion der Injektionserfolg einer sehr kleinen Flüssigkeitsmenge gesichert werden, da bei einem absolut dichten System die Injektion von 2 μl Injektionslösung, die Thioninsäule in dem Schlauch eine Strecke von mindestens 4 cm zurücklegen muss. Durch die Luftblasen als Abstandshalter sowie dem destillierten Wasser kann wiederum eine Kontamination der Injektionslösung durch das Thionin ausgeschlossen werden.
Die Mikroinjektion wurde an frei beweglichen Ratten in einem Beobachtungskäfig durchgeführt. Direkt vor dem Einführen der Injektionskanülen in die Führungsrohre wurde die Funktionsfähigkeit des Injektionssystems anhand der Bildung eines kleinen Tropfens an der Kanülenspitze überprüft. Erst dann wurden die Kanülen gegen die Mandrins ausgetauscht und in die Führungsrohre eingeschoben, wobei sie 1,5 mm über den Rand des Führungsrohres und damit exakt in den rechten bzw. linken Seitenventrikel hinein reichten. Nach einer Wartezeit von einer Minute wurden in zweiminütigen Intervallen jeweils 250 nl der Injektionslösung über einen Zeitraum von einer Minute appliziert. Zur Kontrolle wurde die zurückgelegte Strecke der Thioninlösung im FEP-Schlauch gemessen.
Im Anschluss an die letzte Injektion wurde nach drei weiteren Warteminuten die Kanüle gegen den Mandrin ausgetauscht. Die 8malige Applikation von 250 nl Lösung (insgesamt 2 μl) sollte den Volumeneffekt auf das Hirngewebe minimieren. Zusätzlich sicherten die Warteminuten eine ausreichende Diffusionszeit, um auf diese Weise eventuelle Volumeneffekte aufgrund einer Akkumulation der Lösung auszuschließen. Die längere Wartezeit im Anschluss an die letzte Injektion sollte darüber hinaus ein Mitreißen der Lösung bei Entfernung der Kanüle vermeiden.
Als Injektionslösung wurden eine endo-N-Lösung und eine Vehikellösung verwendet. Zur Herstellung der endo-N-Lösung wurde das Enyzm mit frisch angesetzter und steril filtrierter artifizieller Cerebrospinalflüssigkeit oder autoklavierter PBS-Lösung verdünnt. Die endo-N- und die Vehikellösung wurden bis zur Injektion auf Eis gekühlt. Die optimale endo-N-Konzentration wurde in Vorversuchen ermittelt und betrug 1:1000.
4.4 RÖNTGENBESTRAHLUNG
Um den Effekt einer supprimierten Neurogenese auf das Amygdala-Kindling zu untersuchen, wurde die Zellteilung der neuronalne Vorläuferzellen mit Hilfe ionisierender Strahlung blockiert. Bisherige Bestrahlungstechniken sind jedoch unzureichend, um dieser Fragestellung nachzugehen. In Zusammenarbeit mit den kooperierenden Arbeitsgruppen von Herrn Prof. Seifert und Herrn Dr. Lüpke, Medizinische Physik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, sowie Herrn Prof. Karstens und Herrn Dr. Baumann, Strahlentherapie und Spezielle Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover, wurde daher eine neue radiologische Methode zur Inhibition der Neurogenese etabliert.
Zu diesem Zweck wurde die aus Blei bestehende Grundplatte sowie die Ohrstifte des stereotaktischen Apparates (Fa. Kopf, Tujunga, Kalifornien, USA) gegen selbsthergestellte Plexiglasbestandteile ausgetauscht. Auf diese Weise konnte das Risiko einer Ablenkung der Röntgenstrahlung durch die Bleibestandteile vermieden werden. Im Anschluss wurde eine mit Chloralhydrat (360 mg/kg, i.p.) narkotisierte Ratte in den umgebauten stereotaktischen Apparat eingespannt. Die Ausdehnung des Hippocampus wurde ausgehend von Bregma in den drei Raumebenen bestimmt und auf dem Kopf der Ratte markiert. Unter Verwendung von Bleielementen wurde nun der Kathodenstrahl des Linerbeschleunigers auf die Größe des zu bestrahlenden Areals angepasst und der optimale Bestrahlungswinkel bestimmt. Die Strahleneintrittsstelle am Tier wurde durch ein Silikonpflaster geschützt, da die Röntgenstrahlung beim Wechsel des Umgebungsmediums eine hohe Aufschlagsenergie abgibt.
Der Bestrahlungsmodus bestand aus zwei Durchgängen. Im ersten Durchgang wurde der Bestrahlungswinkel so bestimmt, dass die Strahlung von lateral in den Schädel eindrang, die Hippocampi beider Hemisphären durchzog und auf der gegenüberliegenden Kopfseite verlies. Der Linearbeschleuniger wurde dann um 180° um die Ratte gedreht und das Tier derart umplatziert, dass der Strahlengang beim zweiten Durchgang von der anderen Seite ebenfalls von lateral in den Schädel eindrang. Mit dieser Methode wurde gewährleistet, dass die gewünschte Strahlendosis von ca. 8 Gy nur im Kreuzungspunkt der beiden Strahlengänge erreicht wurde. Im Kreuzungspunkt lag der Hippocampus, während die umliegenden Regionen unbelastet blieben bzw. lediglich von einer zu vernachlässigenden
Peripheriestrahlung erfasst wurden.
Für die Ermittlung der effektiven Bestrahlungsdosis sind unter anderem die Fraktionierung, also die Häufigkeit der Bestrahlung, der Abstand zwischen den Intervallen und die jeweils gewählte Strahlendosis notwendig. Die Berechnung der effektiven biologischen Dosis erfolgte nach dem Linear-Quadratischem-Modell (α/β-Modell) und wurde von Herrn Dr.
Lüpke nach folgender Formel durchgeführt:
E/α: effektive biologische Dosis n: Anzahl der Fraktionen
n.d: Gesamtdosis d: Einzeldosis
α/β: 3 Gy für spät reagierendes Gewebe, 10 Gy für früh reagierendes Gewebe
Es wurden zwei Bestrahlungsfraktionen á 5 Gy im Abstand von sieben Tagen durchgeführt. Früh reagierendes Gewebe besitzt einen hohen α/β-Wert und damit eine geringe Reparaturkapazität, während spät reagierendes Gewebe einen niedrigen α/β-Wert und eine hohe Reparaturkapazität besitzt. Wird fraktioniert oder protrahiert bestrahlt, kann sich spät reagierendes Gewebe im Bestrahlungsintervall erholen. Tab. 5 gibt beispilehaft die α/β-Werte verschiedener Gewebe an.
Früh reagierendes Gewebe α/β Spät reagierendes Gewebe α/β
Dünndarm 6 – 13 Rückenmark 1,6 – 5
Dickdarm 10 – 12 Niere 0,5 – 5
Haut 9 – 19 Leber 1,4 – 3,5
Kallus 9 – 10 Lunge 2,5 – 6,3
⎟ ⎟
⎟
⎠
⎞
⎜ ⎜
⎜
⎝
⎛ +
⋅
⋅
=
α β α
d d E n
1
Knochenmark 9 Haut 2,5 – 4,5
Spermatogonien 13 Schilddrüse 2,5 – 4,5 Tumoren α/β
Plattenepithelkarzinome 25 Adenokarzinome 10 – 20
Tab. 5: Ausgewählte α/β-Werte für unterschiedliche Gewebetypen.
Da proliferierende neuronale Vorläuferzellen als früh reagierendes Gewebe eingestuft werden müssen, lässt sich abschätzen, dass die biologischen Effekte der beiden Bestrahlungen auf diese Zellen des Gehirns einer Einzelbestrahlung von ca. 8 Gy entsprechen. Das Ergebnis ergibt sich aus folgender Berechnung:
Das Gehirn besitzt einen α/β = 3 Gy, also d1 = 7,6 Gy Durchgeführte Bestrahlung: n = 2, d = 5 Gy
α/β = 3 Gy => E/α = 26,7 Gy α/β = 10 Gy => E/α = 15 Gy
Dieselbe effektive biologische Dosis E/α erhält man mit n=1 mit folgendem d1:
α/β = 3 Gy und E/α = 26,7 Gy => d1 = 7,6 Gy
4.5 VERHALTENSPHYSIOLOGIE
Alle verhaltensphysiologischen Untersuchungen wurden in einem speziell für Mäuse bzw.
Ratten eingerichteten, separaten Labor durchgeführt. Diese beiden Labore werden ausschließlich für verhaltensphysiologische Fragestellungen verwendet. Alle Untersuchungen erfolgten mit Unterstützung eines Tracking-Systems (Noldus Ethovision, Niederlande) zur computergestützten Datenerhebung. Bei allen Versuchen mit Ratten produzierte darüber hinaus ein Generator während der gesamten Versuchszeit ein konstantes weißes Rauschen (60 dB), um auditive Störreize zu maskieren. Alle Tiere wurden vor den Versuchen regelmäßig gehandelt, um den handlingbedingten Stress für alle Tiere gleich zu halten.
Die im Rahmen diese Arbeit verwendeten Test zur Beurteilung verschiedener Verhaltensparameter werden im Folgenden erläutert.
Openfield
Das Openfield (OF; deutsch: Offenfeld) gehört zu den ältesten und am häufigsten verwendeten Methoden der tierexperimentellen Verhaltensforschung. Es besteht aus einer Arena, in die das Tier gesetzt wird. In dieser können allgemeine Bewegungs- und Erkundungsaktivitäten erfasst werden. Aufgrund des räumlichen Aufenthaltsmusters, der Defäkation und weiteren Verhaltensäußerungen sind weiterhin Aussagen über die Ängstlichkeit von Tieren möglich.
Für die Versuche mit Ratten wurde ein schwarzes, rundes (Ø 82 cm) 24,5 cm hohes OF verwendet, während für die Versuche mit Mäusen ein hellgraues, rechteckiges (60 cm Länge, 60 cm Breite, 39 cm Höhe) OF verwendet wurde. Als Beleuchtung dienten indirekte Lichtquellen, die im Zentrum des OF zu einer Beleuchtungsstärke von 210 lx (Ratte) bzw. 100 lx (Maus), am Rand zu einer Beleuchtungsstärke von 110 lx (Ratte) bzw.
90 lx (Maus) und in den Ecken des Mäuse-Openfields zu einer Beleuchtungsstärke von 80 lx führte.
Vor Beginn jeden Versuches wurden die Tiere aus dem Heimkäfig genommen und in einen Transportkäfig gesetzt, der in der Nähe des OF eine Minute lang platziert wurde. In dieser Zeit konnten sich die Tiere an die Versuchsbedingungen akklimatisieren, bevor der Experimentator das Tier so in die Mitte des OF gesetzt hat, dass die Blickrichtung für jedes Tier gleich war. Der Experimentator verließ anschließend den Raum. Während des 10 min dauernden Versuchsdurchganges wurde das Verhalten des Tieres mit Hilfe des Tracking-Systems erfasst. Die aufgezeichneten Verhaltensparameter: gelaufene Gesamtstrecke, mittlere Laufgeschwindigkeit, Anzahl und Dauer des Aufrichtens und Putzens wurden anschließend ausgewertet.
Elevated-Plus-Maze
Das Elevated-Plus-Maze (EPM; deutsch: erhöhtes, plusförmiges Labyrinth) ist das am weitesten verbreitete Paradigma zur Messung von Angstverhalten. Es basiert auf spontanen Verhaltensweisen der Tiere, die als anxiogen oder anxiolytisch interpretiert werden können. Grundlage des Tests ist ein Konflikt des Tieres, zwischen dem Bedürfnis eine neue Umgebung explorieren zu wollen und der Angst vor erhöhten, offenen Flächen.
Das EPM besteht aus je zwei erhöhten (85 cm Ratte/ 65 cm Maus), sich gegenüberliegenden offenen und durch Begrenzungswände geschlossenen Armen, die als ein Pluszeichen angeordnet sind. Für Ratten wurde ein schwarzes EPM mit 114 cm langen und 14 cm breiten Armen verwendet. Die Begrenzungswände waren 29 cm hoch.
Für die Versuche mit Mäusen wurde ein graues EPM verwendet, dessen Arme 65 cm x 5 cm lang und breit waren. Die Begrenzungswände hatten eine Höhe von 15 cm.
Die Tiere wurden zu Beginn in jeweils gleicher Orientierung in den Kreuzungsbereich der Apparatur gesetzt und ihr Verhalten in den folgenden fünf Minuten aufgezeichnet. Es können folgende Parameter ausgewertet werden: gelaufene Gesamtstrecke, mittlere Laufgeschwindigkeit, Anzahl und Dauer der Eintritte in die offenen Arme, Anzahl und Dauer des Aufrichtens (rearings), Anzahl und Dauer des Hinabschauens (headdips) von den offenen Armen.
Black-White-Box
Die Black-White-Box (BWB; deutsch: Hell-Dunkel-Kammer) ist ein weitere Test zur Erfassung des Angst-assoziierten Verhaltens von Nagetieren. Als nachtaktive Tiere halten Ratten und Mäuse sich bevorzugt im Dunklen auf. Dieses adaptive Verhalten wird u. a.
durch „gesunde“ Angst induziert. Demnach verbringen ängstliche Nagetiere weniger Zeit in einer aversiven hellen Umgebung und betreten pro Zeiteinheit seltener hellere Bereiche als weniger ängstliche Tiere.
Die Black-White-Box besteht aus einem schwarzen (Ratten: 37 cm x 27 cm x 21 cm;
Mäuse: 35 cm x 33 cm x 29 cm) und einem weißen Kompartiment (Ratten: 37 cm x 27 cm x 21 cm; Mäuse: 17 cm x 33 cm x 29 cm), die durch einen offenen Durchgang miteinander verbunden sind. Durch direkte und indirekte Beleuchtung betrug die Beleuchtungsstärke des weißen Kompartiments 530 lx (Ratte) bzw. 300 lx (Maus) und in der schwarzen Seite 50-70 lx (Ratte) bzw. aufgrund der Verwendung eines Deckels 0 lx (Maus).
Die Tiere wurden zu Beginn in den weißen Bereich der Box gesetzt, wobei der Kopf des Tieres auf die dem Durchgang gegenüberliegende Wand gerichtet war. Jeder Versuchsdurchgang betrug fünf Minuten. Es wurden folgende Parameter ausgewertet:
Dauer des Aufenthaltes im weißen bzw. schwarzen Kompartiment, Anzahl der Übertritte, Latenz bis zum ersten Übertritt von dem weißen in den schwarzen Bereich, Anzahl und Dauer des Aufrichtens im weißen Boxanteil.
Morris-Water-Maze
Das Water-Maze nach Morris (Morris 1984) (MWM; deutsch: Wasserlabyrinth nach Morris) ist das zurzeit am häufigste verwendete Modell zur Erfassung des räumlichen Lernens bei Nagetieren. Die Aufgabe des Versuchstieres besteht in diesem Paradigma darin, die Position einer nicht sichtbaren Plattform in einem mit Wasser gefüllten Bassin zu erlernen (D’Hooge and DE Deyn, 2001). Motiviert wird das Suchverhalten durch die Aversität des Bassins (Hodges 1996), die durch kaltes Wasser erhöht wird.
Das Bassin (Ratte: Ø 150 cm, 60 cm Höhe, Wasserfüllhöhe 30 cm; Maus: Ø 100 cm Durchmesser, 49 cm Höhe, Wasserfüllhöhe 25 cm) wurde täglich mit 22 °C kaltem Wasser gefüllt. Die Wassertemperatur wurde am Ende jedes Versuchtages erneut bestimmt und wich nie um mehr als 2 °C ab. Das Becken wurde mittels einer gedachten Nord-Süd-Linie und West-Ost-Linie in vier gleichgroße Quadranten geteilt. Zur Orientierung der Versuchstiere wurden sog. Extra-Maze-Cues aufgestellt (Ratte & Maus: 20 cm x 20 cm großes schwarzes Kreuz auf weißem Hintergrund im südöstlichen Quadrant; 20 cm x 37 cm großes quergestreiftes schwarz-weißes Rechteck im Westen; 20 cm x 20 cm großer weißer Punkt auf schwarzem Hintergrund im Norden). Die Beleuchtungsstärke im Mausbecken betrug 350 lx, bei der Ratte ca. 300 lx.
Tail-Suspension-Test
Der Tail-Suspension-Test dient der Erfassung des Depressions-assoziierten Verhaltens bei Mäusen. Er beruht auf der Tatsache, dass die Tiere einer aversiven Situation entkommen wollen, jedoch nicht können. Nach einer Zeit geben die Tiere jegliche Fluchtversuche auf. Dieses Verhalten wird als depressionsähnlich gewertet, da die Motivation der Tiere der aversiven Situation zu entkommen, akut durch die Applikation von Antidepressiva gesteigert werden kann.
Die Maus wird über ein Klebeband mit dem Schwanzende an einer 30 cm über einer Tischplatte befindlichen Stange verbunden. Das Tier wird sechs Minuten in dieser
„kopfüber“ Position hängen gelassen. Erfasst werden die Gesamtdauer der Immobilität und die Latenz bis zum Auftreten der Immobilität.
Porsolt-Swim-Test
Der Porsolt-Swim-Test auch Forced-Swim-Test genannt, dient ebenfalls der Erfassung des depressions-assoziierten Verhaltens bei Mäusen und Ratten. Auch in diesem Paradigma wird das Tier einer aversiven Situation ausgesetzt, der es nicht entkommen kann. Das Aufgeben jeglicher Versuche dieser aversiven Situation zu entgehen, wird ebenfalls als depressions-assoziiert beurteilt und kann durch die akute Applikation von antidepressiv wirkenden Substanzen gesteigert werden.
Ein Tier wurde am ersten Versuchstag in einen mit 22 °C warmen Wasser gefüllten Zylinder gesetzt aus dem es nicht entkommen konnte (Maus: 26 cm hoher Zylinder, Ø 18cm, Wasserhöhe 12 cm, Beleuchtung 70 lx; Ratte: 60 cm hoher Zylinder, Ø 39 cm, Wasserhöhe 30 cm). Die Versuchsdauer betrug 10 min und wurde auf Video aufgezeichnet und die Auswertung auf der Basis einer Videoanalyse durchgeführt. Erfasst wurde die Dauer der Gesamtimmobilität. Am folgenden Tag wurde der Versuch unter gleichen Bedingungen wiederholt, jedoch bereits nach 5 min abgebrochen. Neben der Gesamtimmobilität wurde die Latenz bis zum Auftreten der Immobilität festgehalten.
Da im Gegensatz zu den Mäusen ist die Beurteilung der Immobilität bei Ratten sehr schwierig, da Ratten keine vollständige Immobilität sondern lediglich stark reduzierte Schwimmbewegungen zeigen. Aus diesem Grunde war eine sichere, standardisierte Differenzierung nicht möglich und somit wurde im Rahmen dieser Arbeit auf die Auswertung dieses Versuchs verzichtet.
4.6 HISTOLOGIE
Mit der Methode der Immunhistologie können verschiedene Veränderungen neuronaler Plastizität, insbesondere in der hippocampalen Region, dargestellt werden. Neben der Fokussierung auf Veränderungen in der Neubildung, Überlebensrate und Netzwerkintegration hippocampaler Neurone, wurde in dieser Arbeit das Ausmaß neurodegenerativer Prozesse in dieser Gehirnregion ermittelt.
4.6.1 Probengewinnung und Aufbereitung
Zur Perfusionsfixierung wurden die Tiere zunächst mit 500 mg/kg Chloralhydrat tief narkotisiert. Bei der Perfusionsfixierung wird das natürliche Gefäßsystem des Körpers für eine schnelle Fixierung des Gewebes verwendet. Hierfür wurde eine Knopfkanüle vom linken Herzventrikel in die Aorta geschoben. Das rechte Herzohr wurde aufgeschnitten, um den Abfluss des Blutes und der Perfusionslösung zu erlauben. Der gleichbleibende Perfusionsdruck wurde durch die Positionierung der Flaschen mit der Perfusionslösung bestimmt. Dieser entsprach ungefähr dem Blutdruck des Tieres. Bevor das eigentliche
Fixans verwendet wurde, wurde der Blutkreislauf der Ratte mit 0,01 M phosphatgepufferter 0,9% Kochsalzlösung (pH-Wert 7,6) vorgespült. Zur Fixierung wurde ein 1:1 Gemisch aus 8%igem Paraformaldehyd in 0,2 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) mit einer Temperatur von 4 °C verwendet.
Nach der Perfusion wurden die Gehirne entnommen und in eine 30 %ige Saccharoselösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) überführt. In dieser Saccharoselösung verblieben die Gehirne für mindestens drei Tage. Die Protokolle zur Herstellung der Puffer- und Fixanslösungen sind im Anhang beschrieben.
Zur Gewinnung von Gefrierschnitten wurde das perfusionsfixierte Gehirn auf einem
Zur Gewinnung von Gefrierschnitten wurde das perfusionsfixierte Gehirn auf einem