P ekcec Bedeutung der Neurogenese für Epilepsien
ISBN 3-89963-446-2
Untersuchungen zur Bedeutung der Neurogenese für die Entstehung von Epilepsien und Epilepsie-assoziierten Störungen
Anton Pekcec
9 783899 634464
Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und dem Zentrum für
Systemische Neurowissenschaften Hannover
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U n t e r s u c h u n g e n z u r B e d e u t u n g d e r N e u r o g e n e s e f ü r d i e E n t s t e h u n g v o n E p i l e p s i e n u n d E p i l e p s i e - a s s o z i i e r t e n
S t ö r u n g e n
These
zur Erlangung des Grades eines
D OCTOR OF P HILOSOPHY
- Ph.D. -
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Anton Pekcec aus Bremen
Hannover 2006
ISBN 3-89963-446-2
Supervisor: Prof. Dr. H. Potschka Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Potschka
Univ.-Prof. Dr. R. Gerardy-Schahn
Univ.-Prof. Dr. E. Zimmermann
1. Gutachter/in: Prof. Dr. H. Potschka
(Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. & 3. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. R. Gerardy-Schahn
(Institut für Zelluläre Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover)
Univ.-Prof. Dr. E. Zimmermann
(Institut für Zoologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
4. Gutachter/in: Univ.-Prof. Mag. Dr. Günther Sperk
(Institut für Pharmakologie, Medizinische Universität Innsbruck, Österreich)
Datum der mündlichen Prüfung: 20.10.2006
gefördert durch ein Promotionsstipendium des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften
© Verlag Dr. Hut, München 2006 Sternstr. 18, 80538 München Tel.: 089/66060798
www.dr.hut-verlag.de
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Für meine Familie
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 1
2 Übersicht... 2
2.1 EPILEPSIE... 2
2.1.1 DEFINITION UND BEDEUTUNG... 2
2.1.2 EPILEPSIE-ASSOZIIERTE STÖRUNGEN... 3
2.1.3 TIERMODELLE... 5
2.2 NEUROGENESE... 9
2.2.1 NEUROGENESE IM ADULTEN GEHIRN... 9
2.2.2 NEUROGENESE IM EPILEPTISCHEN GEHIRN... 12
2.2.3 NEUROGENESE UND EPILEPSIE-ASSOZIIERTE STÖRUNGEN... 15
2.2.4 EXPERIMENTELLE MODULATION DER NEUROGENESE – SUPPRESSION DURCH IONISIERENDE STRAHLUNG... 18
2.3 PSA-NCAM-SYSTEM... 20
2.3.1 EINFÜHRUNG... 20
2.3.2 MODULATION DES PSA-NCAM-SYSTEM:TIERMODELLE... 24
2.3.3 EPILEPSIE-INDUZIERTE VERÄNDERUNGEN IM PSA-NCAM-SYSTEM... 27
3 Zielsetzung und Arbeitshypothesen ... 30
4 Material und Methoden ... 33
4.1 ELEKTRISCHE EPILESPIEMODELLE IN RATTEN... 33
4.1.1 VERSUCHSTIERE... 33
4.1.2 IMPLANTATION DER ELEKTRODE UND DER FÜHRUNGSKANÜLEN... 34
4.1.3 IMPLANTATION VON CORTICALSCHRAUBEN BEI MÄUSEN... 36
4.1.4 BEURTEILUNG DER KRAMPFSCHWERE... 36
4.1.5 KINDLING-MODELL... 36
4.1.6 POST-SE-BLA-MODELL... 39
4.1.7 ÜBERWACHUNG SPONTANER ANFÄLLE BEI RATTEN UND MÄUSEN... 40
4.2 CHEMISCHEEPILEPSIE-MODELLE BEI MÄUSEN... 42
4.2.1 VERSUCHSTIERE... 42
4.2.2 GENOTYPISIERUNG... 43
4.3 MIKROINJEKTIONSTECHNIK... 46
4.4 RÖNTGENBESTRAHLUNG... 48
4.5 VERHALTENSPHYSIOLOGIE... 51
4.6 HISTOLOGIE... 55
4.6.1 PROBENGEWINNUNG UND AUFBEREITUNG... 55
4.6.2 NISSL-FÄRBUNG... 56
4.6.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE NACHWEISMETHODEN... 56
4.7 AUSWERTUNGEN UND STATISTIK... 59
4.7.1 AUSWERTUNGEN... 59
4.7.2 BESTIMMUNG DER NEURONENANZAHL... 59
4.7.3 DOPPELMARKIERUNGSSTUDIEN... 59
4.7.4 STATISTIK... 60
4.8 VERSUCHSDESIGN... 60
4.8.1 INHIBITION DER HIPPOCAMPALEN NEUROGENESE MITTELS SELEKTIVER RÖNTGENBESTRAHLUNG: AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 60
4.8.2 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM: AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 61
4.8.3 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM: AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-BLA-MODELL... 62
4.8.4 NEURONALE PLASTIZITÄT IN NCAM- UND ST8SIAIV-DEFIZIENTEN MÄUSEN:AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-KAINAT-MODELL... 63
5 Ergebnisse ... 65
5.1 INHIBITION DER HIPPOCAMPALEN NEUROGENESE MITTELS SELEKTIVER RÖNTGENBESTRAHLUNG: AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 65
5.1.1 VORVERSUCHE... 65
5.1.2 KINDLING... 68
5.2 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM:AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 70
5.2.1 KINDLING... 71
5.2.3 HISTOLOGIE... 80
5.3 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM:AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-BLA-MODELL... 83
5.3.1 INDUKTION EINES SSSE... 84
5.3.2 ÜBERWACHUNG AUF SPONTANE ANFÄLLE... 86
5.3.3 VERHALTENSPHYSIOLOGIE... 86
5.3.4 HISTOLOGIE... 92
5.4 NEURONALE PLASTIZITÄT IN NCAM- UND ST8SIAIV- DEFIZIENTEN MÄUSEN:AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-KAINAT-MODELL... 96
5.4.1 INDUKTION EINES STATUS EPILEPTICUS... 96
5.4.2 ÜBERWACHUNG AUF SPONTANE ANFÄLLE... 98
5.4.3 VERHALTENSPHYSIOLOGIE... 99
6 Diskussion... 110
6.1 INHIBITION DER HIPPOCAMPALEN NEUROGENESE MITTELS SELEKTIVER RÖNTGENBESTRAHLUNG: AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 110
6.2 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM:AUSWIRKUNGEN IM AMYGDALA-KINDLING-MODELL... 113
6.3 MODIFIKATION DER NEURONALEN PLASTIZITÄT IM PSA-NCAM-SYSTEM:AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-BLA-MODELL... 118
6.4 NEURONALE PLASTIZITÄT IN NCAM- UND ST8SIAIV- DEFIZIENTEN MÄUSEN:AUSWIRKUNGEN IM POST-SE-KAINAT-MODELL... 121
6.5 SCHLUSSBETRACHTUNGEN... 124
7 Zusammenfassung ... 126
8 Summary... 129
9 Literaturverzeichnis... 132
10 Anhang... 160
10.1 GERÄTE... 160
10.1.1 GERÄTE FÜR DAS AMYGDALA-KINDLING... 160
10.1.2 GERÄTE FÜR DIE EEG- UND VIDEOÜBERWACHUNG... 160
10.2 LÖSUNGEN UND SUBSTANZEN... 161 10.2.1 PROTOKOLLE FÜR DIE HISTOLOGISCHEN METHODEN... 161 10.2.1.1 Substanzen ... 163
ABKÜRZUNGEN Abb. Abbildung
ADD1 Nachentladungsdauer 1 ADD2 Nachentladungsdauer 2 A. dest. Aqua destillata
ADT Nachentladungsschwelle BLA basolaterale Amygdala BrdU Bromodesoxyuridin bsp. Beispiel
BWB Black-White-Box bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise c control (Kontrolle)
ca. zirka
cm Zentimeter
d day (Tag)
DCX Doublecortin d.h. das heißt
EEG Elektroenzephalogramm endo-N Endoneuraminidase-N EPM Elevated-Plus-Maze
etc. et cetera evtl. eventuell
Fa. Firma
g Gramm
GABA γ-Aminobuttersäure GD Gyrus dentatus
Gy Gray
h hour (Stunde)
HRP Horseraddish Peroxidase
Hz Hertz
init. initial inkl. inklusive
i.c.v intracerebroventriculär i.m. intramuskulär
i.p. intraperitoneal i.v. intravenös Kap. Kapitel
kg Kilogramm lx Lux
LTP long term potentiation (Langzeitpotenzierung) M Molar
max. maximal
MES Maximaler Elektroschock MEZ Mitteleuropäische Zeit
mg Milligramm min Minute mind. mindestens ml Milliliter mm Millimeter ms Millisekunden MWM Morris-Water-Maze
NCAM neural cell adhesion-molecule (neuronales Zelladhäsionsmolekül) NeuN neural specific nuclear protein (neuronales Kernprotein)
nm Nanometer
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
Nr. Nummer
OF Openfield o.g. oben genannt
PBS Phospat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PSA polysialic acid (Polysialinsäure)
PTZ Pentylentetrazol s Sekunde s.c. subcutan SD Anfallsdauer SE Status epilepticus
SEM standard error of the mean (Mittelwertfehler) SGZ subgranuläre Zone
s.o. siehe oben SP spatial probe SS Anfallsschwere
SSSE self sustained status epilepticus (sich selbsterhaltender Status epilepticus) Std. Stunde
s.u. siehe unten
SVZ subventrikuläre Zone Tab. Tabelle
TBS TRIS-gepufferte Kochsalzlösung u.a. unter anderem
u.U. unter Umständen v.a. vor allem
µA Mikroampère µl Mikroliter µm Mikrometer
wt wildtype (Wildtyp) x-ray Röntgenstrahlung z.B. zum Beispiel
ZNS zentrales Nervensystem
1 E INLEITUNG
Epilepsien sind definiert durch das wiederholte und spontane Auftreten von Krämpfen zentralen Ursprungs. Sie zählen zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Weltweit sind ca. 60 Millionen Menschen betroffen. Da bei einem Großteil dieser Patienten Arzneimittel nicht wirksam sind, wird die Lebensqualität infolge der spontanen Anfälle erheblich eingeschränkt. Die u.U. notwendige Aufgabe der beruflichen Tätigkeit und der privaten Freizeitgestaltung, die eingeschränkte Mobilität, sowie eine gesellschaftliche Stigmatisierung epileptischer Menschen erhöhen den Leidensdruck. Die pharmakologische Therapie von Epilepsien beschränkt sich auf die lebenslange Verabreichung von Arzneimitteln, die jedoch mit schweren Nebenwirkungen verbunden ist und das Leben der Menschen selbst bei erfolgreicher Therapie belasten und verkürzen. Aus diesen Gründen wäre eine Prophylaxe, welche die Entstehung einer Epilepsie verhindert, aus medizinischer und sozialer Sicht wünschenswert.
Der Mehrzahl der Epilepsien liegen symptomatische Ursachen, wie z.B. ein Schädelhirntrauma, ein Schlaganfall oder Tumore zu Grunde. Hierdurch kann ein krampfförderndes neuronales Netzwerk entstehen. Jedoch sind die genauen Mechanismen der Epileptogenese (=Entstehungsprozess einer Epilepsie) weitestgehend unklar. Diverse Arbeiten der vergangenen Jahre zeigen, dass es im Rahmen der Epileptogenese zu Veränderungen der neuronalen Plastizität und insbesondere zu einer Störung der Neurogenese (=Neubildung von Neuronen) kommt. Diese anfallsinduzierten Veränderungen, wie die Störung der Neurogenese, könnten an der Ausbildung des epileptischen Netzwerkes beteiligt sein. Weiterhin leiden Epilepsiepatienten vielfach an Lern- und Gedächtnisstörungen. Auch psychische Erkrankungen, wie Depressionen und Angststörungen treten bei Epilepsiepatienten signifikant erhöht auf. Die Ausbildung dieser mit Epilepsie-assoziierten Erkrankungen könnte zudem durch eine anfallsinduzierte, gestörte Neurogenese bedingt sein. Die funktionelle Bedeutung der neuronalen Plastizität und der Neubildung von Neuronen für die Entstehung von Epilepsien und deren Komorbiditäten wurde bislang jedoch nicht charakterisiert. Daher soll diese Arbeit dazu beitragen, die Bedeutung der neuronalen Plastizität und insbesondere der Neubildung von Neuronen im Zusammenhang mit der Epileptogenese aufzuklären.
2 Ü BERSICHT
2.1 EPILEPSIE
2.1.1 Definition und Bedeutung
Epilepsien sind definiert durch das wiederholte und spontane Auftreten von Anfällen zentralen Ursprungs, wobei der Begriff zahlreiche unterschiedliche Krankheitsbilder und Syndrome umfasst (FRÖSCHER und VASELLA, 1994). Epilepsien sind beim Menschen nach dem Schlaganfall die zweithäufigste neurologische Erkrankung sowie die häufigste chronische neurologische Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) bei Tieren (v. a. Hund und Katze) und Menschen (LÖSCHER, 1994; HAUSER, 1999). Die Prävalenz beträgt bei der Weltbevölkerung zwischen 0,5 bis 2,0% (BROWNE und HOLMES, 2001).
Dies entspricht weltweit ca. 60 Millionen Menschen. In der Veterinärmedizin treten Epilepsien mit ähnlicher Symptomatik wie bei Menschen auf, wobei bei Hunden und Katzen auch eine vergleichbare Häufigkeit wie in der Humanmedizin beobachtet wird (LÖSCHER, 2003).
Die Klassifikation der Epilepsien ist wesentlich für eine erfolgreiche Therapie. Epileptische Syndrome und epileptische Anfälle werden nach den Merkmalen Anfallsmuster, Ursache, Alter bei Krankheitsbeginn, auslösende Faktoren und anhand des elektroenzephalographischen Befundes klassifiziert. Der Gelegenheitsanfall wird von der Anfallsserie und dem Status epilepticus (SE) unterschieden. Nach dem Anfallsmuster werden lokalisationsbezogene fokale Epilepsien von generalisierten und unklassifizierbaren Epilepsien unterschieden. Weiterhin wird differenziert nach dem Vorhanden- oder Nichtvorhandensein motorischer Funktionsstörungen, die entweder tonisch, klonisch, tonisch-klonisch, atonisch oder myoklonisch sein können. Fokale Anfälle können in elementar-fokale (ohne Bewusstseinstörung), partial-komplexe (Bewusstseinsbeeinträchtigung), hemilaterale und sekundär generalisierte fokale Anfälle gegliedert werden. Die weitere Unterteilung (idiopathisch, kryptogenetisch und symptomatisch) richtet sich nach der Ätiologie (Commission on Classification and Terminology of the International League against Epilepsy 1989).
Einem großen Anteil der Epilepsien liegen symptomatische Ursachen, wie z.B. ein Schädelhirntrauma, ein Schlaganfall, eine Enzephalitis, perinatale Hypoxien oder Tumore zu Grunde. Diese initialen Insulte können Prozesse einleiten, die zu der Generierung eines prokonvulsiven neuronalen Netzwerkes führen. Die genauen Mechanismen dieses als Epileptogenese bezeichneten Prozesses sind derzeit weitestgehend unklar.
2.1.2 Epilepsie-assoziierte Störungen
Eine Reihe von klinischen Untersuchungen und Patientenbefragungen haben ergeben, dass die Prävalenz psychische Störungen und kognitive Defizite auszubilden bei Epilepsiepatienten im Vergleich zu der Kontrollbevölkerung enorm erhöht ist (TRIMBLE, 1991; KANNER et al., 1996; SWINKELS et al., 2001; BLUMER, 2002; KANNER, 2003;
GILLIAM et al., 2003; DEVINSKY, 2003; HERMAN, 2004). Migräne und Schlafstörungen sind weitere Erkrankungen, die gehäuft bei Epilepsiepatienten zu finden sind (BIGAL et al., 2003; MOTAMEDI und MEADOR, 2003). Daher ist davon auszugehen, dass die mit der Epileptogenese verbundenen neuronalen Netzwerkveränderungen direkt mit dem Auftreten der Epilepsie-assoziierten Komorbiditäten in Zusammenhang stehen.
Insbesondere die Ausbildung einer ZNS-abhängigen Komorbidität erhöht den Leidensdruck der Patienten sehr. Unter den psychiatrischen Erkrankungen dominieren hierbei Depressionen. Die Prävalenz der Entstehung einer Depression liegt für Epilepsiepatienten bei ca. 30%, während die Lebenszeitprävalenz in der übrigen Bevölkerung lediglich bei 16% liegt (HERMAN, 2004). DEVINSKY (2003) geht von einer ähnlich hohen Rate aus, die je nach Epilepsieform zwischen 20 und 40% liegt. Weiterhin scheint es einen Zusammenhang zwischen Anfallsschwere sowie Anfallsfrequenz und dem Auftreten von Depressionen zu geben (CRAMER et al., 2003). KANNER et al. (1996) stellten fest, dass ca. die Hälfte der Patienten mit pharmakologisch kaum kontrollierbaren partiellen Anfällen für ungefähr zwei Wochen nach einem Anfall depressiv waren. In Anbetracht der Tatsache, dass der Suizid eine häufige Todesursache bei Epilesiepatienten ist (JOHNSON et al., 2004), kommt der Diagnose von Depressionen bei diesen Patienten eine besondere Bedeutung zu. Neben Depressionen treten Angststörungen ebenfalls mit einer großen Häufigkeit auf. SWINKELS et al. (2001) stellten in einer Untersuchung mit niederländischen Epilepsiepatienten eine Prävalenz von ca.
25% fest. Angststörungen stehen in Verdacht, die Anfallsfrequenz zu erhöhen (VAZQUEZ und DEVINSKY, 2003). Die Autoren berichten zudem über einen Zusammenhang von epileptischen Anfällen und Angststörungen wie Panikattacken, obsessiv-zwanghafte Störungen, generalisierte Angststörungen und posttraumatischen Stress. Weiterhin muss bedacht werden, dass psychische Störungen ebenfalls aus einer erschwerten Lebenssituation epileptischer Patienten resultieren können. Epilepsie-assoziierte Störungen des angstabhängigen Verhaltens konnten auch in verschiedenen Tiermodellen beobachtet werden. So weisen Ratten, die mit dem Chemokonvulsivum Pentylenetetrazol gekindelt wurden, in konditionierten und unkonditionierten Angsttests ein vermindertes Angst-assoziiertes Verhalten auf. Auch in diversen SE-Modellen (Kap 2.1.3) sind ähnliche Verhaltensänderungen beschrieben worden (SZYNDLER et al., 2002; SZYNDLER et al., 2005; ERDOGAN et al., 2005). In vielen Fällen werden psychiatrische Erkrankungen bei Epilepsiepatienten nicht erkannt und bleiben daher unbehandelt (JOHNSON et al., 2004).
Lern- und Gedächtnisstörungen treten bei einigen Epilepsieformen gehäuft auf (SEIDMAN et al., 1998; ALDENKAMP et al., 1999) und konnten wiederholt in verschiedenen Tiermodellen nachgewiesen werden (SUTULA et al., 1995; SARKISIAN et al., 1997).
Obwohl die meisten Epilepsiepatienten eine ungestörte Intelligenz aufweisen, ist die Wahrscheinlichkeit eine Kognitionsstörung auszubilden extrem erhöht. Dabei sind die neuropathologischen Veränderungen, die der Epilepsie zu Grunde liegen, von entscheidender Bedeutung. So sind Lern- und Gedächtnisstörungen bei der häufigsten Epilepsieform, der Temporallappenepilepsie, sehr wahrscheinlich. Liegt der epileptische Fokus jedoch z.B. in einem Sprachzentrum, so ist die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Wortfindungsstörungen erhöht (MOTAMEDI und MEADOR, 2003). Patienten mit Frontallappenepilepsie leiden hingegen häufiger an einer Störung der Aufmerksamkeit, Problembewältigung oder zeigen motorische Unkoordiniertheit (HELMSTAEDTER et al., 1996). Zudem können Aufmerksamkeits- und Gedächtnisstörungen häufig als Nebenwirkungen der Pharmakotherapie auftreten (Kap. 2.1.3). In Tiermodellen konnte ebenfalls ein Zusammenhang zwischen verminderten kognitiven Leistungen und epileptischen Anfällen gezeigt werden. Dabei können sowohl kürzere, als auch lang andauernde schwerere Anfälle irreversible Auswirkungen auf räumliche und emotionale
Lern- und Gedächtnisvorgänge haben. Faktoren, die den Grad der Verhaltensbeeinträchtigung im Tiermodell beeinflussen sind: genetischer Hintergrund, Alter bei Auftreten der Anfälle, Lokalisation und Ausdehnung des epileptischen Fokus, Schwere, Dauer und Häufigkeit der Anfälle, Umweltbedingungen und das soziale Gefüge in der Tiergruppe (MAJAK und PITKANEN, 2004).
Neben der erhöhten Prävalenz gegenüber neurologischen Erkrankungen treten bei Humanpatienten weitere Beschwerden, wie ein polyzystisches Ovarialsyndrom bei Frauen, gehäuft auf (BORO und HAUT, 2003). Ferner beeinträchtigt die pharmakologische Therapie der Epilepsie die Gesundheit der Patienten und führt zu Nebenwirkungen, wie Störungen des Knochenstoffwechsels und der renalen Funktion (BORO und HAUT, 2003).
Da mit den genannten psychischen und kognitiven Komorbiditäten der Leidensdruck der Patienten erhöht ist, ist eine vertiefte Kenntnis über die neuropathologischen Netzwerkveränderungen, die im Zusammenhang mit der Epileptogenese das Auftreten dieser Erkrankungen begünstigen, wünschenswert.
2.1.3 Tiermodelle
An ein Tiermodell einer Erkrankung werden drei grundlegende Ansprüche gestellt. Zum einen sollten die Symptome im Modell denen der Erkrankung ähneln, zum anderen sollte dem Modell und der Erkrankung der identische Pathomechanismus zu Grunde liegen. Des Weiteren sollte das Modell prädiktiv für die klinische Wirksamkeit von Arzneimitteln sein.
Zur Untersuchung der Mechanismen der Epileptogenese können grundsätzlich Tiermodelle mit induzierten und spontan auftretenden Anfällen verwendet werden. Bei Modellen mit induzierten Anfällen lassen sich Anfälle elektrisch oder chemisch auslösen, wobei ohne diese Induktion keine spontanen Anfälle auftreten. Bei Tiermodellen mit spontan auftretenden Anfällen wird elektrisch oder chemisch ein initialer Insult gesetzt.
Infolgedessen bilden sich nach einer Latenzzeit spontane epileptische Anfälle aus, d.h. ein prokonvulsives neuronales Netzwerk wurde generiert. Solche Modelle eignen sich daher zur Untersuchung der Epileptogenese bei symptomatisch bedingten Epilepsien und spiegeln die klinische Realität vieler epileptischer Patienten wider. Bei diesen entwickelt
sich häufig nach einem initialen Insult, wie z.B. einem Schädel-Hirn-Trauma, eine Epilepsie.
Epileptische Patienten können pharmakologisch lediglich mit einer chronischen Gabe von Antiepileptika behandelt werden. Bei 30% der Patienten ist auf diese Weise jedoch keine zufriedenstellende Anfallsreduktion und Anfallskontrolle möglich (KWAN und BRODIE, 2002). Die Applikation von Antiepileptika ist zusätzlich mit zum Teil schweren Nebenwirkungen verbunden. Darüber hinaus reduzieren die Arzneimittel selbst bei erfolgreicher Anwendung die Lebenserwartung der Patienten. Aus diesen Gründen wäre eine Prophylaxe, die nach einer initialen Schädigung die Entstehung einer Epilepsie verhindert, wünschenswert. Mehrere klinische Prüfungen belegen, dass die Anwendung von Antiepileptika nach einem solchen Insult, mit dem Ziel der Epilepsieprophylaxe, ungeeignet ist (TEMKIN, 2001; BEGHI, 2003). Für die Entwicklung einer zweckmäßigen Vorbeugung ist es daher notwendig, die genauen Mechanismen der Epileptogense zu ermitteln, um substanzielle Zielstrukturen für eine prophylaktische, antiepileptogene Therapie definieren zu können. Für diesen Zweck eignen sich unterschiedliche Tiermodelle. Die Mechanismen der Epileptogenese lassen sich mittels genetischer Modelle (z.B. epileptische Hunde (LOSCHER, 1997), chemischer Tiermodelle (z.B.
Kainsäure (BEN-ARI et al., 1981), Pilocarpin (HONCHAR et al., 1983)) und elektrischer Tiermodelle (z.B. Kindling-Modell (GODDARD et al., 1969b), Post-SE-BLA-Modell (MCINTYRE et al., 1982)) untersuchen.
Amygdala-Kindling-Modell
Im Jahre 1969 wurde von der Arbeitsgruppe des experimentellen Psychologen Graham Goddard das Kindling-Modell an Ratten beschrieben (GODDARD et al., 1969a), das ursprünglich entwickelt wurde, um das Lernverhalten durch subkonvulsive elektrische Stimuli zu beeinflussen. Die wiederholten subkonvulsiven elektrischen Stimulationen führten zu epileptischen Anfällen, die bei weiteren Stimulationen schnell an Schwere und Dauer zunahmen. Dabei wurden die Stimulationen über eine unilaterale Reiz- und Ableitelektrode im Bereich des limbischen Systems gesetzt. Der Begriff „Kindling“ (engl.:
„to kindle“ = entflammen) beschreibt einerseits den fortschreitenden Prozess der
Epileptogenese und andererseits den dadurch erreichten permanenten Zustand einer erhöhten Anfallsbereitschaft.
In der Regel werden die Tiere einmal täglich kurzzeitig (für eine Sekunde) stimuliert. Nach einigen elektrischen Stimulationen mit gleichbleibender Stimulationsstärke zeigen die Tiere zunächst fokale Anfälle, die bei Fortführung der Stimulation sekundär generalisieren.
Die Anfälle lassen sich nach ihrer Krampfintensität im Kindling-Modell in fünf verschiedene Stadien (Kap. 4.1.4) einteilen (RACINE, 1972).
Die ersten drei Verhaltensstadien gleichen dem klinischen Bild von komplex-partiellen Anfällen beim Menschen, die letzten zwei Stadien dem von Anfällen mit sekundärer Generalisierung. Die Empfindlichkeit des Gehirns auf den Stimulus nimmt fortlaufend bis zu einem bestimmten Zeitpunkt zu, an dem der erhöhte Grad der Empfindlichkeit permanent geworden ist. Die Tiere gelten zu diesem Zeitpunkt als „vollgekindelt“
(MCNAMARA, 1984).
Neuere Überlegungen gehen davon aus, dass der Kindling-Prozess einen Teil der Latenzzeit widerspiegelt, die bei Modellen mit spontanen Anfällen nach einem initialen Insult und der Manifestation spontaner Anfälle angesehen wird. Die durch das Kindling verursachte Epileptogenese stellt demnach eine stark ausgedehnte Latenzzeit dar (COULTER et al., 2002), die schließlich, bei ausreichender Anzahl von Stimulationen, auch zur Ausbildung spontaner Anfälle führt (PINEL, 1981).
Post-SE-BLA-Modell
Ein Tiermodell mit spontan auftretenden Anfällen ist die Dauerstimulation der Amygdala (MCINTYRE et al., 1982; HANDFORTH und ACKERMANN, 1988; NISSINEN et al., 2000;
BRANDT et al., 2003). MCINTYRE et al. (1982) entwickelten ein Modell, bei dem durch 60 minütige elektrische Stimulation (60 Hz, 50 µA) der basolateralen Amygdala (BLA) bei gekindelten Ratten ein selbsterhaltender fokaler SE ausgelöst werden konnte, der auch nach Beendigung der Stimulation anhielt. Während der Stimulation trat hauptsächlich ein fokaler Anfallstyp auf, der teilweise sekundär generalisierte. Nach Beendigung der Stimulation konnte fast ausschließlich ein fokaler Anfallstyp beobachtet werden. Nach einem SE wurden nur in der ipsilateralen Hemisphäre Läsionen nachgewiesen.
MCINTYRE et al. (1982) untersuchten nicht, ob bei Ratten mit einem fokalen SE nach
einer Latenzzeit spontane Anfälle auftreten. In einer Folgestudie konnten HANDFORTH und ACKERMANN (1988) erstmalig verschiedener Subtypen eines selbsterhaltenden SE (Self-Sustained-Status-Epilepticus; SSSE) differenzieren. Sie stimulierten die BLA von nicht-gekindelten Sprague-Dawley Ratten über 60 Minuten (60 Hz, 400 µA). Es wurde jedoch nicht untersucht, ob die Tiere mit einem SSSE nach einer Latenzzeit spontane Anfälle entwickeln. NISSINEN et al. (2000) beschrieben ein modifiziertes Modell, bei dem naive Ratten 20 – 30 min mit 400 µA (60 Hz) in der lateralen Amygdala stimuliert werden.
Nach elektrischer Stimulation kam es in den meisten Fällen zu einem SSSE, der 6 – 20 h andauerte. Nach einer Latenzphase entwickelten die Ratten spontane epileptische Anfälle.
Dies bedeutet, dass sich ein übererregbares, epiletisches Netzwerk ausgebildet hat (COULTER et al., 2002). Als pathohistologische Veränderungen zeigten sich Neuronenschwund in der Amygdala, im Hippocampus und im umgebenden kortikalen Gewebe und das Aussprossen von Moosfasern (Axone der Körnerzellen) im Gyrus dentatus (NISSINEN et al. 2000).
Basierend auf den beschriebenen Modellen wurde von BRANDT et al. (2003) ein modifiziertes Stimulationsprotokoll verwendet. Die Ratten (Sprague-Dawley und Wistar Ratten) wurden über 25 Minuten in der BLA elektrisch stimuliert (700 µA). Die elektrisch stimulierten Tiere zeigten drei verschiedene Arten von SSSE (fokal, fokal mit einzelnen generalisierten Anfällen, generalisiert; siehe Kap. 4.1.6). Die prozentuale Verteilung der verschiedenen SSSE-Typen variierte je nach verwendetem Rattenstamm, Geschlecht und Lokalisation der Elektrode. Nur 33% der Ratten mit einem fokalen SSSE entwickelten später epileptische Anfälle, wobei dies bei mehr als 90% der Ratten mit dem SSSE Typ II oder III mit generalisierten Anfällen der Fall war. Um ein späteres Auftreten von spontanen epileptischen Anfällen zu garantieren, musste der generalisierte SSSE mindestens vier Stunden vor Beendigung der Krampfaktivität mit Diazepam andauern. Neurodegenerative Veränderungen waren bei den Tieren mit fokalem SSSE regional begrenzter und nicht so ausgeprägt, wie bei Tieren mit generalisierten SSSE. Die Neuropathologie der Tiere mit einem generalisiertem SSSE ähnelt dem Bild nach einem chemisch (Pilocarpin oder Kainsäure) induziertem SE (BRANDT et al. 2003).
Kainat-Modell
Das Excitotoxin Kainsäure aktiviert den Kainatrezeptor, einen ionotropen Glutamatrezeptorsubtyp. Kainat ist eine Aminosäure, die eine große strukturelle Ähnlichkeit mit Glutamat aufweist, dem wichtigsten excitatorischen Neurotransmitter im ZNS (OLNEY et al., 1974; KANDEL et al., 1996). Die Stimulierung präsynaptischer Rezeptoren resultiert in einer massiven Glutamatfreisetzung, die für die Wirkung von Kainat verantwortlich ist (SPERK, 1994).
Die systemische oder intracerebrale Applikation von Kainat bei Labornagern führt zu fokalen und komplex-fokalen epileptischen Anfällen mit sekundärer Generalisierung und zu einem durch diese Anfallstypen charakterisierten SE „SE-Kainat-Modell“ (BEN-ARI et al., 1979; SCHWOB et al., 1980; BEN-ARI et al., 1981). Nach dem Ende des SE und einer Latenzzeit von einigen Wochen zeigen die Tiere spontan auftretende epileptische Anfälle (Post-SE-Kainat-Modell) (PISA et al., 1980; CAVALHEIRO et al., 1982; CRONIN und DUDEK, 1988). Ein kainatinduzierter SE geht mit massiven Neuronenverlusten in bestimmten Gehirnregionen einher (SCHWOB et al. 1980; BEN-ARI et al. 1981; SPERK et al. 1994). Besonders vulnerable Gehirnregionen sind der piriforme Cortex, der entorhinale Cortex, die Amygdala und die hippocampalen Pyramidenzellschichten CA1, CA3a und CA3c sowie der Hilus des Gyrus dentatus (SCHWOB et al., 1980; LOTHMAN und COLLINS, 1981; NADLER, 1981; SPERK et al., 1983; BEN-ARI, 1985; ALTAR und BAUDRY, 1990; COVOLAN und MELLO, 2000; BRANDT et al., 2003).
2.2 NEUROGENESE
2.2.1 Neurogenese im adulten Gehirn
Während der neuronalen Entwicklung entsteht das Nervensystem aus Stammzellen die sich teilen und zu Zellen der neuronalen und glialen Linie ausdifferenzieren. Obwohl das Gehirn nur eine limitierte regenerative Fähigkeit besitzt, konnte in den letzten Jahrzehnten die Existenz von Zellen mit ähnlichen Eigenschaften im adulten Gehirn von Säugetieren und Menschen nachgewiesen werden (KUHN et al., 2001). Eine kontinuierliche und lebenslange Neubildung von Neuronen, die als Neurogenese bezeichnet wird, findet insbesondere in zwei Regionen statt: In der subgranulären Zone (SGZ) des Gyrus dentatus (GD) des Hippocampus und der Subventrikularzone (SVZ) des anterolateralen
Seitenventrikels (GAGE, 2002; MOMMA et al., 2002). Darüber hinaus konnte die Netzwerkintegration von neugebildeten Nervenzellen auch in anderen Gehirnregionen, wie dem prefrontalen, temporalen, parietalen und piriformen Cortex, dem Striatum und der Amygdala von naiven Primaten (GOULD et al., 1999b; BERNIER et al., 2002; ZHAO et al., 2003), sowie dem piriformen Cortex von naiven Ratten (PEKCEC et al., 2006) nachgewiesen werden.
Die SVZ ist eine der germinativen Zonen im Säugetiergehirn, aus der am meisten neue Neurone hervorgehen (ALTMAN, 1969). Diverse Studien an Labornagern und Primaten konnten die Neubildung von Neuroblasten in der anterioren Region des SVZ nachweisen, die in einer tangentialen, kettenartigen Wanderung entlang des sog. rostral migratory stream (RMS) den Bulbus olfactorius erreichen. Letztlich wandern diese neuronalen Vorläuferzellen radial in die granuläre und periglomuläre Zellschicht der Bulbi ein, um sich hier zu GABAergen und dopaminergen Interneuronen auszudifferenzieren (LOIS und VAREZ-BUYLLA, 1994; KORNACK und RAKIC, 2001; PENCEA et al., 2001; BEDARD et al., 2002; HACK et al., 2005). Für eine ähnlich ablaufende adulte Neurogenese im humanen olfaktorischen System existieren ebenfalls Hinweise (BEDARD und PARENT, 2004).
Aufgrund der besonderen funktionellen Bedeutung des Hippocampus für Lern- und Gedächtnisvorgänge und der pathophysiologischen Bedeutung im epileptischen Geschehen wird in dieser Arbeit die hippocampale Neurogenese im Besonderen herausgestellt. Während des gesamten Lebens proliferieren neuronale Vorläuferzellen in der SGZ des GD im Hippocampus und wandern in die darüberliegende Körnerzellschicht ein, wo sie sich zu reifen Körnerzellen ausdifferenzieren (ALTMAN und DAS, 1965;
CAMERON et al., 1993; KUHN et al., 1996). Diese Form der adulten Neurogenese konnte bei einer Reihe von Säugetieren wie Labornagern, Hunden (PEKCEC et al., subm.), Primaten und beim Menschen nachgewiesen werden (SERESS et al., 1992; ERIKSSON et al., 1998; GOULD et al., 1999a). Die neugebildeten Neurone nehmen über ihre Dendriten Kontakt mit der Molekularschicht des GD und über ihre Axone Kontakt mit Pyramidenzellen des Hilus und der CA3-Region auf (HASTINGS und GOULD, 1999;
MARKAKIS und GAGE, 1999) und integrieren sich zum Teil dauerhaft in das hippocampale, neuronale Netzwerk (van Praag, et al., 2002).
Der hippocampalen Neurogenese wird eine grundlegende Bedeutung für Lern- und Gedächtnisprozesse zugeschrieben (SHORS et al., 2001; MONJE et al., 2002; SHORS et al., 2002; LAACK und BROWN, 2004; KEMPERMANN et al., 2004b). Derzeit sind eine Reihe von Interventionen bekannt, die die hippocampale Neurogenese steigern oder supprimieren. Beeinflusst wird die Proliferation durch Neurotransmittersysteme, Hormone, Wachstumsfaktoren sowie Umweltreize und physische Bewegung (LEHMANN et al., 2005). Darüber hinaus sind Veränderungen der hippocampalen Neurogenese bei neuropathologischen Zuständen und durch Strahlungen bekannt, die ebenfalls in der Studie von LEHMANN et al. (2005) zusammengefasst worden sind.
KEMPERMANN et al. (2004b) haben ein Modell der adulten hippocampalen Neurogenese mit sechs charakteristischen Entwicklungsstadien vorgeschlagen, welche von sich neubildenden Körnerzellen durchlaufen werden (Abb. 1). Morphologische Unterschiede
Nestin
GFAP Doublecortin
Calretinin Calbindin PSA-NCAM
TUC-4 NeuN mitotic
progenitor cells
postmitotic
immature granule cell
mature granule cell type-3
type-2b type-2a
radial glia- like cell
Nestin
GFAP Doublecortin
Calretinin Calbindin PSA-NCAM
TUC-4 NeuN mitotic
progenitor cells
postmitotic
immature granule cell
mature granule cell type-3
type-2b type-2a
radial glia- like cell
Abb. 1: Sechs Phasen der Körnerzellentstehung im adulten Hippocampus (KEMPERMANN et al., 2004a). Eingeteilt auf der Basis der Morphologie, Proliferationsfähigkeit und der Expression verschiedener neuronaler Proteine. Modifizierte Abbildung von H.Potschka.
und das Expressionsmuster von spezifischen Markern sind als Kriterien für die Einteilung herangezogen worden. Demnach teilen sich Stammzellen (type-1 cell) und differenzieren dann zu schnellteilenden neuronalen Vorläuferzellen aus, die sich aufgrund einer unterschiedlichen Proteinausstattung in drei weitere Subklassen gliedern lassen (type-2a, type-2b und type-3 cell). Während die Stammzelle über eine mehr oder weniger gute Regenerationsfähigkeit verfügt, können sich die neuronalen Vorläuferzellen nur in einem engen Rahmen selbsterhalten. Mit dem Austritt der mitotisch aktiven Zellen aus dem Zellzyklus gehen sie in ein transientes, postmitotisches Stadium über (immature granule cell). In dieser Phase werden bereits hergestellte Netzwerkverbindungen etabliert, die letztlich für das Überleben dieser Zellen von Bedeutung sind. In der sechsten und letzten Phase hat sich eine ausdifferenzierte Körnerzelle neugebildet (mature granule cell).
2.2.2 Neurogenese im epileptischen Gehirn
Der Prozess der Entstehung einer Epilepsie, die Epileptogenese, geht mit einer Reihe neuropathologischer Veränderungen des Nervensystems einher (DALBY und MODY, 2001). Die Generierung eines solchen epileptischen Netzwerkes resultiert dabei in der Manifestation einer Epilepsie. Der Verlust von Neuronen durch apoptotische und nekrotische Mechanismen wird dabei als mitverantwortlich für die Induktion dieser plastischen Veränderungen angesehen und könnte zudem für Störungen der hippocampalen Funktion verantwortlich sein (SLOVITER, 1999; DUDEK et al., 2002;
HELMSTAEDTER et al., 2002; PITKANEN und SUTULA, 2002). In diesem Zusammenhang kommt es zu einer axonalen Reorganisation und Veränderung der dendritischen Morphologie von Neuronen, die zu der Ausbildung aberranter synaptischer Verbindungen führen und als relevant für die Entstehung der Hyperexcitabilität in der humanen Epilepsie und in Tiermodellen gesehen wird (WUARIN und DUDEK, 1996;
COVOLAN et al., 2000). Insbesondere fehlerhafte synaptische Verbindungen von Neuronen im Hippocampus tragen zu der Entstehung des prokonvulsiven Netzwerkes bei (SLOVITER, 1999; RATZLIFF et al., 2002). So wird ein Aussprossen von Moosfasern beobachtet, die keine Verbindungen zu Pyramidenzellen der CA-3 Region aufnehmen, sondern stattdessen zurücklaufende, aberrante synaptische Verbindungen mit anderen Körnerzellen der Körnerzellschicht des GD ausbilden. Auf diese Weise könnten
amplifizierende Feedback-Kreisläufe entstehen, die eine wesentliche Bedeutung in der Anfallsinitiierung und Propagation haben. Die Entstehung dieser hyperexcitablen Feedbackschleifen scheint BDNF (brain derived neurotrophic factor)-abhängig zu sein (KOYAMA et al., 2004).
Im Rahmen der Epileptogenese kommt es weiterhin zu einer Aktivierung von Gliazellen, die ebenfalls an den plastischen Veränderungen beteiligt sind. Reaktive Astrozyten weisen abweichende Membraneigenschaften und elektophysiologische Veränderungen auf und sind an prokonvulsiven Umbauprozessen der extrazellulären Matrix beteiligt. Sie tragen auf diese Weise zu der Generierung eines epileptischen Netzwerkes bei (D'AMBROSIO et al., 2004). Zudem sezernieren aktivierte Mikroglia pro-inflammatorische Cytokine, die Neurone gegenüber Anfällen sensitivieren (BERNARDINO et al., 2005). Darüber hinaus mehren sich Hinweise für eine Beteiligung der Neurogenese an der Epileptogenese- assoziierten Plastizität (PARENT, 2002; PARENT und LOWENSTEIN, 2002; PARENT et al., 2006).
In akuten Krampfmodellen konnte bei Nagern wiederholt eine anfallsinduzierte massive Steigerung der hippocampalen Neurogenese festgestellt werden. Diese ist im Kindling- Modell, sowie in Epileptogenese-Modellen ebenfalls nachweisbar (BENGZON et al., 1997;
PARENT et al., 1998; GRAY und SUNDSTROM, 1998; NAKAGAWA et al., 2000;
NAKAGAWA et al., 2004; CRESPEL et al., 2005; PARENT et al., 2006). CRESPEL et al.
(2005) fanden zudem eine Induktion der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in Hippocampi humaner Patienten mit Temporallappenepilepsie.
Die Induktion der Körnerzellneurogenese ist dabei durch ein zum Teil atypisches Verhalten der neugebildeten Neurone gekennzeichnet. So bilden einige der neugebildeten Körnerzellen aberrierende Axone aus, die in die supragranuläre Zone reichen.
BUCKMASTER et al. (2002) konnten in einer quantitativen Analyse zeigen, dass 95% der Synapsen von Moosfasern mit apikalen Dendriten von anderen Körnerzellen und nur 5%
mit inhibitorischen GABAergen Neuronen gebildet werden. Das aberrante Aussprossen von Moosfasern wird aus diesem Grunde von vielen Autoren als prokonvulsive Umstrukturierung des Hippocampus angesehen (RIBAK et al., 2000; RATZLIFF et al., 2002; BUCKMASTER et al., 2002; RIBAK und DASHTIPOUR, 2002; CAVAZOS et al.,
2003; SHAPIRO und RIBAK, 2005) und konnte auch in reseziertem Humangewebe nachgewiesen werden (SUTULA et al., 1989; HOUSER et al., 1990; BABB et al., 1991).
Durch eine weitreichende Unterdrückung der hippocampalen Neurogenese mittels einer Röntgenbestrahlung konnten PARENT et al. (1999) jedoch beweisen, dass die aberrante Moosfasersprossung nicht ausschließlich von neugebildeten Körnerzellen ausgeht, sondern auch von reifen Neuronen. Diese Beobachtung wurde letztlich von COVOLAN et al. (2000) bestätigt (PARENT et al., 1999; COVOLAN et al., 2000).
Zum anderen wandern anfallsinduziert einige neuronale Vorläuferzellen in den geschädigten Hilus des Hippocampus und differenzieren dort zu sogenannten ektopischen Körnerzellen, die ihrerseits aberrante synaptische Verbindungen zu Moosfasern aufnehmen (DASHTIPOUR et al., 2002) und Axonkollaterale in die innere Molekuraschicht senden (SCHARFMAN et al., 2000). Diese Beobachtung konnte wiederholt tierexperimentell und in Resektionspräparaten humaner Patienten gemacht werden (SCHARFMAN et al., 2002; JESSBERGER et al., 2005; PARENT et al., 2006). Ektopische Körnerzellen finden sich anfallsinduziert ebenso in der Molekularschicht des GD. Diese Untersuchungen deuten auf ein anfallsinduziertes abnormes Migrationsmuster von Neuroblasten im Hippocampus hin, die zu einer aberranten Netzwerkintegration von neugebildeten Neuronen führt und an der Entstehung und Progression von epileptischen Anfällen beteiligt sein könnte (SHAPIRO und RIBAK, 2005; PARENT et al., 2006).
Funktionelle Untersuchungen der ektopischen Körnerzellen ergaben, dass sich diese Zellpopulation sowohl orthodrom über eine perforant path-Stimulation, als auch antidrom über eine Moosfaserstimulation aktivieren lassen. Weiterhin weisen sie typische Membrancharakteristika von Körnerzellen auf, zeigen jedoch eine Hyperexzitabilität und eine abnorme spontane Aktivität, das sogenannte burst firing (SCHARFMAN et al., 2000;
SCHARFMAN et al., 2001; SCHARFMAN et al., 2002; SCHARFMAN et al., 2003). In der gleichen Studie konnte gezeigt werden, dass die Zellen funktional in limbische Schaltkreise integriert sind, eine anfallsinduzierte hohe c-fos Expression aufweisen und daher an der Entstehung spontaner Anfälle beteiligt sein könnten.
Morphologisch unterscheiden sich die ektopischen Körnerzellen im Hilus und an der Grenze zwischen Hilus und Körnerzellschicht durch das gehäufte Auftreten persistierender basaler Dendriten von normalen Körnerzellen (SPIGELMAN et al., 1998; BUCKMASTER
und DUDEK, 1999; RIBAK et al., 2000; DASHTIPOUR et al., 2003; SHAPIRO et al., 2005). SPIGELMAN et al. (1998) stellten dabei als erste in epileptischen Ratten ein Auftreten von in den Hilus ziehenden basalen Dendriten bei 5-16% aller markierten Körnerzellen fest. Diese Entdeckung wurde von BUCKMASTER und DUDEK (1999) für das Kainat-Modell und von DASHTIPOUR et al. (2003) für das Pilocarpin-Modell bestätigt.
Persistierende basale Dendriten sind bereits wenige Tage nach Pilocarpininjektion zu beobachten und partizipieren im neuronalen Netzwerk durch Afferenzen von Moosfasern (RIBAK et al., 2000; DASHTIPOUR et al., 2003). In einer aktuellen Studie konnten SHAPIRO et al. (2005) zeigen, dass das Auftreten von persistierenden basalen Dendriten von neugeblideten Körnerzellen ausgeht. Weiterhin sind die persistierenden basalen Dendriten ektopischer Körnerzellen signifikant länger als die transient auftretenden basalen Dendriten von sich entwickelnden normalen Körnerzellen von Kontrolltieren (SHAPIRO et al., 2005). Zudem weisen sie eine erhöhte Anzahl excitatorischer Synapsen auf (RIBAK et al., 2000; DASHTIPOUR et al., 2001). Ektopische Körnerzellen könnten aufgrund dieser prokonvulsiven Eigenschaften zur Reduktion der Krampfschwelle und zur Anfallsgenerierung beitragen. Aus den bisher genannten Gründen könnte eine anfallsinduzierte Störung der Neurogenese mit atypischer Netzwerkintegration von neugebildeten Nervenzellen zu der Generierung des epileptischen Netzwerkes und damit der Epileptogenese beitragen.
2.2.3 Neurogenese und Epilepsie-assoziierte Störungen
Verschiedene Untersuchungen deuten auf einen Zusammenhang zwischen einer Dysfunktion der hippocampalen Neurogenese und psychiatrischen Erkrankungen, neuropathologischen Erkrankungen und kognitiven Störungen hin (DUMAN et al., 2000;
JACOBS et al., 2000; KEMPERMANN et al., 2002; SANTARELLI et al., 2003;
MONTARON et al., 2006). Der hippocampalen Neurogenese wird eine fundamentale Bedeutung für Lern- und Gedächtnisleistung von hippocampusabhängigen Aufgaben beigemessen (SHORS et al., 2001; SHORS et al., 2002; KEMPERMANN et al., 2004b;
MONTARON et al., 2006). Eine Hypothese von KEMPERMANN et al. (2004) besagt, dass die Integration der neuen Körnerzellen im tri-synaptischen Netzwerk des Hippocampus in einer „Flaschenhalsposition“ stattfindet, und hierdurch selbst wenige neue Neurone einen
sehr großen Einfluss auf das Gesamtsystem haben. Die Adaptation des neuronalen Netzwerkes durch die Integration von neuen Neuronen an dieser Stelle wird durch eine Vielzahl von Experimenten gestützt. So korreliert weniger die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen als vielmehr die totale Anzahl integrierter neuer Neurone mit dem Lernergebnis im Water-Maze-Test bei Ratten (GALLAGHER et al., 2000; DRAPEAU et al., 2003; BIZON und GALLAGHER, 2003). Daher wird vermutet, dass eine anfallsinduzierte Störung der Neurogenese mit einer fehlerhaft veränderten Netzwerkintegration der neugebildeten Zellen, in funktionellen Ausfällen wie kognitiven Defekten resultieren kann (PARENT, 2002).
Die genaue Ätiopathogenese von Depressionen ist zurzeit unklar. Eine Hypothese geht von Störungen des neuroendokrinen Systems in Form einer Dysregulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse aus. Anhaltender Stress führt zu einer kontinuierlich hohen Ausschüttung von Glukokortikoiden, die zu einer Schädigung hippocampaler Neurone führen (MAGARINOS et al., 1999; MCEWEN, 1999; DUMAN et al., 2001). Der Hippocampus ist hemmend an der Regulation der Hypothalamus- Hypophysen-Nebennierenachse beteiligt. Die Schädigung resultiert daher in einem Verlust der Inhibition mit der Folge einer zusätzlich gesteigerten Glukokortikoidfreisetzung, die wiederum zu einer verstärkten Störung hippocampaler Neurone führt und vice a versa. Die Reduktion der hippocampalen Neurone erfolgt durch eine direkte Zellschädigung, durch eine Verringerung der zellulären Widerstandskraft, durch eine Reduktion der BDNF- Ausschüttung und durch die Inhibition der Neurogenese (GOULD et al., 1998; CZEH et al., 2001). Da neuronale Vorläuferzellen keine Glukokortikoidrezeptoren besitzen (CAMERON et al., 1993), erfolgt die Hemmung der Neurogenese nicht direkt über Glukokortikoide sondern durch andere Mechanismen. Es wäre denkbar, dass Änderungen in der Zusammensetzung von neurotrophen Faktoren und insbesondere die Reduktion der BDNF-Freisetzung maßgeblich daran beteiligt sind. Außerdem wird vermutet, dass BDNF in der Pathophysiologie der Depressionen eine Schlüsselrolle zukommt (KEMPERMANN und KRONENBERG, 2003). MONTARON et al. (2005) konnten zudem zeigen, dass erhöhte Glukokortikoidlevel im Alter die hippocampale Funktion über eine Suppression der Neurogenese stören und damit in diesem Kontext von funktioneller Relevanz sind.
Diverse Antidepressiva wie Fluoxetin (spezifischer Serotonin-Reuptake-Inhibitor), Reboxetine (spezifischer Norepinephrin-Reuptake-Inhibitor), Tranylcypramin (Monoaminoxidase-Inhibitor), Rolipram (Phosphodiesterase-IV-Inhibitor) erhöhen die neuronale Vorläuferzellproliferation und die Neuronenintegration (MALBERG, 2004). Diese Substanzen besitzen keine akute Wirkung, sondern einen erst nach Wochen einsetzenden Effekt auf die Neurogenese, welcher zeitgleich mit der therapeutischen Wirkung einhergeht (KEMPERMANN & KRONENBERG, 2003; MALBERG, 2004). Alle weiteren antidepressiven Therapien, wie z.B. die elektrokonvulsive Therapie, oder physische Aktivität besitzen einen ähnlichen starken Effekt auf die Neurogenese (VAN et al., 1999a;
VAN et al., 1999b; MADSEN et al., 2000; SCOTT et al., 2000). SANTARELLI et al. (2003) konnten mittels einer hippocampalen Röntgenbestrahlung zeigen, dass die antidepressive Wirkung in einem Angstparadigma von der Netzwerkintegration von neugebildeten Neuronen abhängig ist. Weiterhin zeigten tierexperimentelle Untersuchung in unterschiedlichen Depressiontests ebenfalls eine Reduktion der hippocampalen Neurogenese, die sich mit einer Vorbehandlung mit Antidepressiva verhindern lies. Auf diese Weise konnten ebenfalls die typischen neuronalen Schädigungen in der CA3-Region des Hippocampus und die Hemmung der BDNF-Freisetzung verhindert werden. Mittels einer elektrokonvulsiven Therapie ließ sich außerdem der Effekt der Stresseinwirkung auf die hippocampale Neurogenese umkehren (NIBUYA et al., 1995; CRYAN et al., 2002;
HELLSTEN et al., 2002). Alle genannten Gründe weisen auf eine Kopplung von Stress, antidepressiver Wirkung und Neurogenese hin. Multiple Untersuchungen an depressiven Patienten offenbarten ein verringertes hippocampales Volumen. Der Grad der Schrumpfung korreliert dabei mit der Länge der Erkrankung (MACQUEEN et al., 2003). Im Gegensatz dazu gleicht das hippocampale Volumen von Patienten mit antidepressiver Therapie denen von Kontrollpersonen (SHELINE et al., 2003). Dieses Phänomen wird als weiterer Hinweis für eine Suppression der Neurogenese und wahrscheinliche Ursache von Depressionen gewertet (MALBERG, 2004). Andere Autoren sehen hingegen in der reduzierten Neurogenese lediglich ein Epiphänomen von Depressionen ohne ätiologischen Zusammenhang (VOLLMAYR et al., 2003; HENN und VOLLMAYR, 2004).
Die Bedeutung einer gestörten Neurogenese für die Pathogenese von psychiatrischen
Erkrankungen und kognitiven Defiziten wurde vielfach diskutiert (KEMPERMANN und KRONENBERG, 2003; BERGER et al., 2003; MALBERG, 2004; MONTARON et al., 2006). Derzeitig existieren viele Bemühungen, die ätiopathologische Bedeutung der Neurogenese in diesem Zusammenhang zu untersuchen und neue therapeutische Strategien abzuleiten. Aus den genannten Gründen könnten anfallsinduzierte Veränderungen im Schicksal und in der Netzwerkintegration von neugebildeten Körnerzellen auch eine ursächliche Bedeutung für die psychiatrische und kognitive Komorbidität bei Epilepsiepatienten haben.
2.2.4 Experimentelle Modulation der Neurogenese – Suppression durch ionisierende Strahlung
Der Effekt einer ionisierenden Strahlung auf proliferierende Zellen, wie z.B. neuronale Vorläuferzellen, wurde bereits in vivo als auch in vitro wiederholt untersucht und charakterisiert. Eine Strahlendosis von 1-15 Gy ist dabei geeignet, in Mäusen und Ratten zu einer effizienten und lang anhaltenden Suppression der hippocampalen Neurogenese zu führen, ohne größere Nebenwirkungen auf die Versuchstiere zu haben (WOJTOWICZ, 2006). Der Grad der Schädigung der neuronalen Vorläuferzellen ist dabei dosisabhängig, was wiederholt mit immunhistologischen Nachweisverfahren bestätigt wurden. Dabei deuten Proliferationsmarker wie BrdU und Ki-67 auf eine verminderte, von der Dosis der Strahlung abhängige, Zellteilung hin. Die lang anhaltende Reduktion neuronaler Vorläuferzellmarker wie Doublecortin, TOAD-64 und PSA-NCAM bestätigen diesen Effekt, der über Wochen bis Monate andauern kann (PARENT et al., 1999; PEISSNER et al., 1999; TADA et al., 2000; MIZUMATSU et al., 2003; ROLA et al., 2004; SZYNDLER et al., 2005). Neben der röntgenologischen Suppression der Neurogenese ist eine Hemmung der Zellteilung durch zytotoxische Agentien wie Methylazoxymethanol möglich (SHORS et al., 2001; SHORS et al., 2002). Wegen der insuffizienten Suppression der Zellteilung (DUPRET et al., 2005) und der massiven systemischen Nebenwirkungen, vor allem das Immunsystem der Tiere betreffen, ist die experimentelle Verwendung jedoch fraglich.
Methodiken der experimentell suppremierten Neurogenese wurden in der Vergangenheit insbesondere für „loss of function“-Untersuchungen erfolgreich eingesetzt (PARENT et al., 1999; SNYDER et al., 2001; SANTARELLI et al., 2003; SNYDER et al., 2005) und
bestätigten die Bedeutung der Neurogenese für kognitive Vorgänge.
In bisherigen Studien (PEISSNER et al., 1999; MONJE und PALMER, 2003) wurde eine Suppression der Neurogenese durch eine Bestrahlung des gesamten Tierkörpers oder des Kopfes erreicht. Bei der letzteren Methode wurde der Körper des Tieres durch eine Bleiplatte von der Strahlung abgeschirmt. SANTARELLI et al. (2003) verfeinerten die Behandlungsweise, indem sie das gesamte Tier vor der durch eine Bleiplatte vor der Strahlung schützen. Es war lediglich eine kleine Öffnung direkt über der Schädeldecke im Bereich des Hippocampus vorhanden. Auf diese Weise konnte die hippocampale Neurogenese ohne stärkere Beeinträchtigung der proleferierenden Zellen der SVZ inhibiert werden. Mit dieser Methode ist jedoch der Erfolg der Behandlung auf die hippocampale Neurogenese unter weitestgehender Schonung der übrigen neurogenen Zonen wie der SGZ (LOIS und VAREZ-BUYLLA, 1994; KORNACK und RAKIC, 2001;
PENCEA et al., 2001; BEDARD et al., 2002; HACK et al., 2005), und die Migration von Vorläuferzellen wie im piriformen Cortex (PEKCEC et al., 2006) aufgrund der anatomischen Ausrichtung des Hippocampus nur unzureichend zu gewährleiset.
FERLAND et al. (2003) untersuchten den Effekt der Bestrahlung des Kopfes von Mäusen im Fluorothyl-Kindling Modell. In diesem Modell wurden Mäuse an acht aufeinander folgenden Tagen bis zum Auftreten klonischer, aus dem Vorderhirn entspringender Anfälle dem Inhalations-Chemokonvulsivum Fluorothyl ausgesetzt. Die Suppression der Neurogenese führte nicht zu einer Veränderung der Latenz bis zum Auftreten der Anfälle über die einzelnen Tage (FERLAND et al., 2003). Analog zum Amygdala-Kindling bei Ratten bleibt der Zustand einer erhöhten Anfallsbereitschaft permanent, was sich in dem Erhalt einer erniedrigten Schwelle (=Latenz bis zum Auftreten generalisierter Anfallsaktivität) ausdrückt. Zwischen bestrahlten und nichtbestrahlten Mäusen konnte nach einer erneuten Fluorothyl-Exposition nach zwei oder vier Wochen kein Unterschied in der Höhe dieser Schwelle festgestellt werden. Jedoch nehmen die Anfälle bei einer erneuten Fluorothyl-Exposition an Schwere zu (seizure shift), wobei in der Anfallsaktivität bei der Mehrzahl der Tiere der Hirnstamm einbezogen wird. Die Bestrahlung führte beim Fluorothyl-Kindling jedoch nicht zu einer Verringerung der Anfallsschwere, woraus die
Autoren schließen, dass die anfallsinduzierten Veränderungen der hippocampalen Neurogenese nicht an der hyperexzitablen Umstrukturierung des Netzwerkes beteiligt sein können (FERLAND et al., 2003). Wie die Autoren jedoch selber feststellen, erfolgt die Anfallsausbreitung in diesem Modell vom Vorderhirn vor allem über den ventromedialen Nucleus des Hypothalamus zum Stammhirn. Zwar sollen iktale EEG-Veränderungen im Hippocampus während Fluorothylinduzierter Anfälle auftreten, doch ist die Beteiligung dieser Hirnstruktur an der Anfallspropagation in diesem Modell bisher nie nachgewiesen worden. Aus diesem Grunde bleibt die genannte Schlussfolgerung der Autoren mehr als spekulativ.
2.3 PSA-NCAM-SYSTEM 2.3.1 Einführung
Das neuronale Zelladhäsionsmolekül, neural cell adhesion molecule (NCAM), ist ein Glykoprotein der Immunoglobulin-Superfamilie der Zelladhäsionsmoleküle. Der extrazelluläre Anteil besteht aus fünf Immunoglobulin-ähnlichen Anteilen mit 6 N- Glykolysierungsstellen und zwei Fibronektin Typ III Domänen. Durch alternatives splicing eines einzelnen Gens mit 26 Exons existieren diverse NCAM-Isoformen (SMALL et al., 1988; THOMPSON et al., 1989; BARTHELS et al., 1992). Im Nervensystem von Vertebraten dominieren jedoch drei Isoformen, zwei transmembranäre Isoformen mit einem Molekulargewicht von 180 und 140 kDa, sowie eine Glycosylphosphatidylinositol- gekoppelte Isoform mit einem Molekulargewicht von 120 kDa.
Ligand/ Substrat
fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR 1)
(WILLIAMS et al., 1994; KISELYOV et al., 2003; HINSBY et al., 2004)
glia cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) und GDNF family receptor α
(PARATCHA et al., 2003)
L1 Zelladhäsionsmolekül (HORSTKORTE et al., 1993) TAG-1/Axonin-1 (MILEV et al., 1996)
Neurocan (FRIEDLANDER et al., 1994)
Phosphacan (MILEV et al., 1994)
Agrin (STORMS et al., 1996)
Kollagen (PROBSTMEIER et al., 1989;
KISELYOV et al., 1997)
Heparin, Chondroitinsulfat (COLE et al., 1985; COLE und GLASER, 1986; NYBROE et al., 1989; GRUMET et al., 1993; KISELYOV et al., 1997;
CAMBON et al., 2004)
Prion-Protein (SCHMITT-ULMS et al., 2001) Glukokortikoid Rezeptor (CROSSIN et al., 1997)
platelet-derived neurotrophic factor (PDNF)
(ZHANG et al., 2004)
brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
(VUTSKITS et al., 2001)
Tollwut Virus (THOULOUZE et al., 1998)
ATP (DZHANDZHUGAZYAN und BOCK,
1993; KISELYOV et al., 2005)
Spectrin (POLLERBERG et al., 1986)
focale adhesion kinase p125fak und tyrosin kinase p59fyn
(BEGGS et al., 1997)
diverse Zytoskelettanteile (BUTTNER et al., 2003)
Tab. 1: Zusammenstellung von heterophilen Substraten von NCAM nach Kiselyov et al. (2005).
NCAM vermittelt Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Substrat-Verbindungen. Homophile NCAM- Bindungen sind dabei in Form von trans-Verbindungen (zwischen zwei NCAM-Molekülen sich gegenüberliegender Zellen) und als cis-Verbindung (zwischen zwei NCAM-Molekülen derselben Zellmembran) möglich. Als heterophile Substrate von NCAM sind bereits eine Reihe von Molekülen bekannt und von KISELYOV et al. (2005) zusammengestellt worden (Tab. 1).
Durch die homophilen cis- und trans-Verknüpfungen werden stabile Zell-zu-Zell-Kontakte
geknüpft (RONN et al., 1998), die für den neurochemischen und elektrischen Austausch zwischen benachbarten Zellen von grundlegender Bedeutung sind. Über den Ras/MAP- Kinase Weg (CROSSIN et al., 2001) und die Aktivierung von Phospholipase C (DOHERTY et al., 1996; DOHERTY et al., 2000) ist eine Vermittlung von intrazellulären Signalen möglich. NCAM kann darüber hinaus direkt mit Tyrosin-Rezeptor-Kinasen, wie dem FGFR 1 interagieren. Diese Interaktion könnte den Rezeptor direkt aktivieren oder die FGF- FGFR-Bindung erleichtern (DOHERTY et al., 2000).
Das NCAM-Molekül kann einer posttranslationalen Modifikation unterzogen werden, wobei zwei Ketten von Polysialinsäure (PSA) an zwei Asparaginreste des fünften Ig-Moduls gebunden werden können. PSA ist ein langes, lineares Homopolymer aus α-2,8 verknüpfter Sialinsäure. Ein PSA-Strang kann aus 50 und mehr Monomeren bestehen, wobei die Kettenlänge zwischen den einzelnen NCAM-Isoformen variiert. Im ZNS ist NCAM der einzige Träger von PSA. Während der embryonalen Entwicklung liegt NCAM zu 30% in der PSA-gebundenen Form vor (PSA-NCAM). Dieser Anteil nimmt jedoch post partum schnell ab. Im adulten ZNS ist NCAM vornehmlich unpolysialyliert; lediglich in bestimmten Hirnregionen, wie z.B. dem Hippocampus, der Amygdala und dem olfaktorischem System, ist eine kontinuierliche Expression von PSA-NCAM feststellbar.
PSA besitzt eine besondere Bedeutung für die neuronale Plastizität. Die langen Ketten sind stark negativ geladen und bringen die Ig-Domänen der NCAM-Moleküle in eine antiparallele Ordnung. Der Verlust der Parallelität bewirkt einen schlechteren Kontakt von trans-verknüpften NCAM-Molekülen und damit eine Abnahme der Adhäsion (RUTISHAUSER et al., 1988; KLEENE und SCHACHNER, 2004). Aber auch laterale cis- Verbindungen werden durch die stark negativ geladenen PSA-Ketten aufgebrochen.
Darüber hinaus können Liganden an die PSA-Ketten binden, so dass große Cluster entstehen. Der Grad der Polysialylierung von NCAM ist entscheidend dafür, ob NCAM somit als Plastizität vermittelndes oder Stabilität schaffendes Molekül fungiert (RONN et al., 2000; BRUSES und RUTISHAUSER, 2001). Folglich kommt PSA-NCAM eine besondere Bedeutung während der neuronalen Entwicklung zu. Im adulten Gehirn bleibt PSA-NCAM in Gehirnregionen mit einer hohen neuronalen Plastizität und anhaltender lebenslanger Neurogenese, wie dem Hippocampus und dem olfaktorischen System,
prominent (MUHLENHOFF et al., 1998; SEKI, 2002b; KLEENE und SCHACHNER, 2004).
PSA-NCAM schafft somit die Voraussetzungen für die mit der Nervenzellneubildung einhergehenden Netzwerkveränderungen durch Zellmigration, Neuritenwachstum und Reorganisation von Neuriten. Die Abhängigkeit der Synaptogenese und der Rekonstruktion hippocampaler Synapsen vom PSA-NCAM-System konnte zudem wiederholt bestätigt werden (DITYATEV et al., 2004; WASHBOURNE et al., 2004). Die PSA-vermittelte Abnahme der adhäsiven Eigenschaften von NCAM ist eine entscheidend Voraussetzung für die Zellmigration während der adulten Neurogenese. Weiterhin wird durch die mit der PSA-Expression einhergehende Clusterbildung ein für die Proliferation günstiges Mikromillieu um die neuronalen Vorläuferzellen geschaffen. So könnten PSA- tragende Zellen einen Selektionsvorteil für die nur in geringen Mengen vorkommenden positiv geladenen neurotrophen Faktoren haben, die sie für ihr Überleben benötigen.
Diese Vermutung wird durch die Beobachtung gestützt, dass das Fehlen oder die Inaktivierung von PSA in vitro die Mortalität von corticalen Neuronen erhöht (VUTSKITS et al., 2001). Das Überleben dieser Neurone lässt sich wiederum durch den neurotrophen Faktor BDNF schützen (VUTSKITS et al., 2001). Zusätzlich wird diese Annahme durch in vitro Versuche von AMOUREUX et al. (2000) bestätigt. Amoureux und seine Kollegen beobachteten einen sofortigen Abbruch der Proliferation und eine verstärkte Ausdifferenzierung von hippocampalen neuronalen Vorläuferzellen zu Neuronen nach PSA-Verlust. Aufgrund der direkten PSA-NCAM-Interaktionen mit den Tyrosin-Kinasen- Rezeptoren könnte weiterhin die Wirkung der Wachstumsfaktoren mit ihren Rezeptoren potenziert werden (AMOUREUX et al., 2000).
Das vorwiegend an den Wachstumskegeln von Neuriten zu findende NCAM-180 ist in seiner polysialylierten Form primär am Neuritenwachstum beteiligt. Das Neuritenwachstum scheint weiterhin über die intrazelluläre Phospholipase C-Signalkaskade sowie den Ras/MAP-Kinase Weg vermittelt zu werden (DOHERTY & WALSH, 1996; DOHERTY et al., 2000; CROSSIN et al., 2001). Ein Verlust von PSA führt zu einer Inhibition des NCAM- stimulierten Neuritenwachstums (DOHERTY et al., 1990). DOHERTY et al. (2000) konnten zudem zeigen, dass neurotrophe Faktoren, wie FGF und BDNF, über einen PSA- abhängigen Mechanismus das Aussprossen sowie das Wachstum der Neuriten verstärken.
