Mutanten mit einer konstitutiven AtGLS Expression

Nach dem Screen (siehe 3.5.3.1 und 3.5.3.2) wurden die überlebenden Pflanzen (AtGLS::PAT) sowie die Pflanzen mit konstitutiver Emission von Licht nach Gabe von Luciferin (AtGLS::LUC) auf Erde angezogen und anschließend, soweit möglich, Samen geerntet. Die Samen wurden dann erneut ausgelegt und der ursprünglich beobachtete Phänotyp soweit möglich reproduziert. Pflanzen, deren Phänotyp (Überleben nach Behandlung mit Basta™ bzw. konstitutive Emission von Licht nach Luciferin-Behandlung) auch in dieser Generation sichtbar war, wurden auf ihre Genexpression überprüft.

Abbildung 4.29 Schematische Darstellung des Screening-Verfahrens und die dabei erhaltenen mutagenisierten Pflanzen

Der Ablauf und die Ergebnisse des Screens sind in Abbildung 4.29 dargestellt. Bei der Selektion von mutagenisierten Pflanzen mit konstitutiver Luciferase-Aktivität fällt besonders die hohe Anzahl von Kandidaten nach der ersten Selektion auf, unter denen sich nach weiterer Überprüfung sehr viele Falschpositive befanden. Ein Grund für diesen Befund scheint die hohe Sensitivität dieses Verfahrens zu sein, das zu einem positiven Signal führt, wenn die Pflanze einen leichten transienten Stress hatte. Dieser führt zur geringen Aktivierung des AtGLS-Promotors, ohne dass dafür eine genetische Ursache besteht. Tatsächlich zeigten zwei Kandidaten auch in der nächsten Generation eine konstitutive Emission von Licht nach Gabe von Luciferin (siehe Abbildung 4.30), aber dennoch war keine wesentlich erhöhte AtGLS-Transkriptmenge zu detektieren (Daten nicht gezeigt). Selbst wenn die Ursache für die Luciferase-Aktivität in einer Mutation begründet ist, wurden in diesem Fall die AtGLS-Transkriptmengen nur marginal beeinflusst. Da diese Mutanten durch eine Neutronenmutagenese entstanden sind, ist eine Mutation im Promotor des chimären AtGLS::LUC Gens, die zu konstitutiver Promotor-Aktivität führt, nicht wahrscheinlich. Aus dem gleichen Grund handelt es sich vermutlich auch nicht um einen partiellen Verlust des negativen Regulators. Das heißt, dass vermutlich in beiden Mutanten keine zentralen Prozesse der Signalkaskade beeinflusst wurden, die zur AtGLS-Transkription führen.

AtGLS::LUC AtGLS::PAT AtGLS Expression : 2 ein steriler

Kandidat

Abbildung 4.30 Foto von nicht mutagenisierten AtGLS::LUC-Pflanzen (oben) im Vergleich zu den Nachkommen zweier mutagenisierten Pflanzen (Linie #T links und Linie #W rechts) im Licht aufgenommen (schwarz-weiß) mit einer Darstellung des von den Pflanzen emittierten Lichtes (Falschfarben). Im Farbverlauf von blau nach rot ist eine Zunahme der Lichtintensität dargestellt. Die Pflanzen wurden im Langtag angezogen und nach 3 Wochen für die Aufnahme verwendet.

In der Population wurde eine weitere Mutante entdeckt, die eine konstitutive Luciferase-Aktivität aufwies. Die Pflanze war allerdings nicht fertil und konnte deshalb nicht weiter analysiert werden. Wie in Abbildung 4.31 zu sehen ist, wies die Pflanze ein stark verlangsamtes Wachstum auf und zeigte eine deutliche Rotfärbung der Blätter. Es war weiterhin ein deutliche Luciferase-Aktivität in dieser Mutante zu beobachten.

Nachdem sich herausstellte, dass die Mutante nicht fertil ist, wurde eine weitere Mutante mit dem selben Phänotyp aus dem gleichen Pool selektiert. Es ist möglich, dass diese Mutante eine umfangreiche Aktivierung einer Signalkaskade aufweist, die auch für die Induktion der AtGLS verantwortlich ist. Die Aktivierung der gesamten Signalkaskade resultiert vermutlich in der Aktivierung vieler Gene, deren Expression Ressourcen kostet, die der Pflanze dann für das Wachstum fehlen. Alamethicin induziert die AtGLS-Transkription, löst im Gegensatz zu MeJA aber keine Rotfärbung der Blätter aus (Daten nicht gezeigt). Man würde also erwarten, dass die Induktion der AtGLS und die Induktion der Gene, die verantwortlich für die Rotfärbung der Blätter sind, voneinander unabhängig induziert werden können. Es ist deshalb nicht wahrscheinlich, dass beide durch den gleichen negativen Regulator kontrolliert werden.

Es ist eher zu vermuten, dass ein Gen oberhalb von COI1 durch eine Mutation betroffen ist, die zur Erhöhung de JA-Mengen führt.

Abbildung 4.31 Phänotyp einer mutagenisierten Pflanze aus der AtGLS::LUC-Population

(A) nicht mutagenisierte AtGLS::LUC-Pflanze (Kontrolle) wurde zwei Wochen auf MS-Medium mit 1%

Sucrose unter Langtagsbedingungen angezogen

(B) mutagene Pflanze aus der AtGLS::LUC-Population (Linie #B) wurde wie in A beschrieben angezogen.

(C) 8 Wochen alte auf Erde angezogene mutagenisierte Pflanze aus der AtGLS::LUC-Population (Linie

#B). Der Durchmesser der Rosette betrug ca. 1 cm.

(D) Foto von nicht mutagenisierten AtGLS::LUC-Pflanzen wie unter A beschrieben (links durch einen weißen Pfeil markiert) im Vergleich zur mutagenisierten Pflanze wie unter B beschrieben (rechts) im Licht aufgenommen (schwarz-weiß) mit einer Darstellung des von den Pflanzen emittierten Lichtes (Falschfarben). Im Farbverlauf von blau nach rot ist eine Zunahme der Lichtintensität dargestellt.

A

B

C D

Beim Screen nach Überlebenden im AtGLS::PAT-Hintergrund wurden nur sehr wenige mutagenisierte Pflanzen erhalten, die Anzahl der Falschpositiven war dementsprechend gering. Eine Pflanze, deren Nachkommen reproduzierbar resistent waren, zeigte ein verzögertes Wachstum und eine leichte Rotfärbung der Blätter. Diese Pflanze wies aber weder Transkript für das PAT-Gen noch für die AtGLS auf (Daten nicht gezeigt).

Zwei weitere mutagenisierte Linien, deren Nachkommen reproduzierbar resistent gegen Basta™ sind, zeigten eine erhöhte AtGLS-Expression. Diese werden im folgenden als AtGLS::PAT ceg (constitutive expression of geranyllinalool synthase) bezeichnet und mit den Nummern AtGLS::PAT ceg#1 und AtGLS::PAT ceg#2 bezeichnet. Die Linie AtGLS::PAT ceg#1 zeigt einen deutlichen Phänotyp; die Blätter weisen auf den Kotyledonen Läsionen auf, sie wachsen langsamer und die Pflanze hat eine rötliche Blattfärbung (siehe Abbildung 4.32). Die AtGLS-Expression ist gegenüber AtGLS::PAT Pflanzen 100 fach induziert, allerdings ist die Menge an gebildetem Transkript deutlich geringer als bei einer mit Alamethicin behandelten Pflanze (siehe Abbildung 4.32). Die Linie AtGLS::PAT ceg#2 zeigt dagegen keinen offensichtlichen Phänotyp (Daten nicht gezeigt). Eine Transkript-Analyse zeigte allerdings, dass die unbehandelte Mutante eine 61 fach gesteigerte AtGLS-Transkriptmenge gegenüber einer unbehandelten AtGLS::PAT-Pflanze aufweist. Diese Mutante weist ähnliche AtGLS- Transkript-Mengen auf wie eine mit Alamethicin behandelten Pflanze (siehe Abbildung 4.33). Die Analyse dieser Mutanten könnte in Hinblick auf die Tatsache, dass es in EMS-mutageniserten Pflanzen auch zu einem partiellen Funktionsverlust kommen kann (siehe 4.3.2), der einen schwächeren Effekt zur Folge hat, interessant sein. Der nächste Schritt in der Analyse dieser Mutante bestände in der Kreuzung mit der coi1-Mutante. Die Mutation in einem negativen Regulator sollte den Effekt unabhängig von COI1 zeigen.

Abbildung 4.32 Phänotyp und AtGLS-Expression von Nachkommen einer mutagenisierten Pflanze (ceg#1) aus der AtGLS::PAT-Population

(A) Real-time-PCR-Analyse einer unbehandelten nicht mutagenisierten AtGLS::PAT-Pflanze im Vergleich zu der unbehandelten Mutante AtGLS::PAT ceg#1 und einer Wildtyp Pflanze die für 31h mit Alamethicin behandelt wurde. Auf der Y-Achse ist der Faktor zwischen der AtGLS-Transkriptmenge und der Transkript-Menge des Referenzgens PP2A (At1g1320) angegeben (für eine detaillierte Beschreibung der Methode siehe 3.5.2). Der Faktor zwischen der AtGLS::PAT und der AtGLS::PAT ceg#1 ist über dem Pfeil angegeben

(B) Foto von drei Wochen alten auf Erde gewachsenen unbehandelten AtGLS::PAT (links) und AtGLS::PAT ceg#1 (rechts) Pflanzen

(C) Nahaufnahme von 2 Wochen alten AtGLS::PAT Pflanzen (D) Nahaufnahme von 2 Wochen alten AtGLS::PAT ceg#1 Pflanzen

C D

AtGLS::PAT

ceg#1 Wt Ala

fache Expresionüber Referenz

AtGLS::PAT

A

B

x 100 0

2 4 6 8 10 12

AtGLS

Abbildung 4.33 AtGLS-Expression von unbehandelten Nachkommen einer mutagenisierten Pflanze (AtGLS::PAT ceg#2) aus der AtGLS::PAT-Population

(A) Real-time-PCR-Analyse einer unbehandelten nicht mutagenisierten AtGLS::PAT-Pflanze im Vergleich zu einer unbehandelten Mutante (AtGLS::PAT ceg#2) und einer Wildtyp (Wt)- Pflanze die für 31h mit Alamethicin (Ala) behandelt wurde. Auf der Y-Achse ist der Faktor zwischen der AtGLS-Transkriptmenge und der Transkript-Menge des Referenzgens PP2A angegeben (für eine detaillierte Beschreibung der Methode siehe 3.5.2). Der Faktor zwischen der AtGLS::PAT und der AtGLS::PAT ceg#2 ist über dem Pfeil angegeben.

(B) 3 Wochen alte AtGLS::PAT-(oben), 35S::PAT-(links) und AtGLS::PAT ceg #2-(rechts) Pflanzen, die 6 Tage nach der Aussaat für 10 Tage täglich mit 2 mM Phosphinotricin besprüht worden sind.