Die Emission von TMTT korreliert mit der Expression von At1g61120 45

das einen limitierenden Schritt in der Synthese katalysiert, ebenfalls durch Alamethicin induzierbar sein. GGPP ist ein notwendiges Substrat für viele essentielle Stoffwechselwege, daher kann vermutet werden, dass das erste regulierte Enzym eine Diterpensynthase ist, die aus GGPP das Produkt Geranyllinalool bildet (siehe 1.3). In A.

thaliana gibt es 32 Terpensynthasen (TPS) (AUBOURG et al., 2002). Ausgehend von der Annahme, dass die Regulation auf der Ebene der Transkription stattfindet, wurden alle TPS mit RT-PCR daraufhin getestet, ob eine Steigerung des Transkriptes durch Behandlung mit Alamethicin erfolgt (CHEN et al., 2003b).

Bei dieser Analyse fielen vier Gene besonders auf. Drei von ihnen (At2g24210, At4g16730, At4g16740) weisen eine große Homologie zu Monoterpensynthasen auf.

At2g24210 und At4g16740 sind jeweils bereits als Myrcen/Ocimen-Synthase (BOHLMANN et al., 2000) bzw. Ocimen-Synthase (FALDT et al., 2003) charakterisiert worden. Die enzymatische Aktivität von At4g16730 ist unbekannt, allerdings spricht die Homologie zu den Monoterpensynthasen gegen eine Funktion als Diterpensynthase. Bei der vierten TPS handelt es sich um At1g61120, die eine größere Homologie zu den Diterpensynthasen des primären Stoffwechsels aufweist (AUBOURG et al., 2002). Diese Kriterien machen At1g61120 zu einem viel versprechenden Kandidaten für die vermutete Geranyllinalool-Synthase. Um die Hypothese weiter zu untermauern, wurden verschiedene Bedingungen, die zur TMTT-Produktion führen, daraufhin untersucht, ob es unter diesen Bedingungen ebenfalls zur Steigerung des At1g61120-Transkriptes kommt. Bei den Bedingungen handelt es sich zum einen um eine Induktion mit dem Coronatin-Derivat Coronalon (SCHULER et al., 2004), zum anderen um eine Infektion mit dem Herbivoren Plutella xylostella. Diese beiden Reize wurden mit der bereits charakterisierten Alamethicin-Induktion

verglichen. In Abbildung 4.3 ist zu erkennen, dass Alamethicin, Coronalon und Infektion mit P. xylostella zur Emission von TMTT führen und gleichzeitig in der Lage sind, das Transkript des Gens At1g61120 zu induzieren. Hier besteht also eine Korrelation zwischen dem Auftreten des Transkriptes und der TMTT Emission. P.

xylostella ist auch in der Lage die Emission größerer Mengen GL zu induzieren, allerdings findet sich in dieser Probe auch die größte Menge TMTT. Das Fehlen von GL in den mit Alamethicin behandelten hydroponischen Pflanzen ist vermutlich darin begründet, dass hier die Synthese von GL weniger stark induziert ist und die geringeren Mengen effizient in TMTT umgesetzt werden, so dass es zu keiner Akkumulation von GL kommt.

Abbildung 4.3 Vergleich der Emission von Volatilen und der Expression von At1g61120 in A. thaliana nach Behandlung mit den Elicitoren Alamethicin und Coronalon sowie nach Infektion mit P. xylostella (A) Emission der vier häufigsten Volatile. Alamethicin (5 µg/ml) wurde über die Petiolen abgeschnittener Blätter verabreicht oder wie auch Coronalon (100 µM) über die Wurzeln hydroponisch angezogener Pflanzen appliziert. Für die Infektion mit P. xylostella wurden 50 Raupen im 3. bis 4. Larvenstadium pro Pflanze verwendet. Volatile wurden von 21 bis 30 h nach Beginn der Behandlung gesammelt. Die Ergebnisse geben die Werte und Standardabweichnungen von drei Experimenten wieder. Daten wurden von D. Tholl erfasst.

(B) Northern-Blot-Analyse der At1g61120-Transkription in Arabidopsis Blättern nach Induktion mit Coronalon und Alamethicin (beides über die Wurzeln hydroponisch kultivierter Pflanzen appliziert) sowie nach Infektion mit P. xylostella.

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4.1.3 At1g61120 Insertionslinien zeigen keine Emission von TMTT und GL nach Induktion mit Coronalon

Für eine funktionelle Charakterisierung des Gens At1g61120 wurden zwei T-DNA-Insertionslinien (salk_039864 und salk_078187) im Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) bestellt. Aus den erhaltenen Samen wurden homozygote Pflanzen isoliert (siehe 3.1.2.9). In Abbildung 4.4A ist zu erkennen dass in salk_039864 die Insertion im 6. Intron liegt, während die Linie salk_078187 eine T-DNA Insertion im 8.

Exon aufweist. Beiden Linien fehlt im Gegensatz zum Wildtyp das At1g61120-Transkript nach Induktion mit Coronalon (siehe Abbildung 4.4B). Die homozygoten T-DNA-Insertionslinien wiesen bis auf die fehlende Transkription von At1g61120 keinen Phänotyp bezüglich des Wachstums (siehe 4.1.5), der Entwicklung oder der Blatt- und Blütenmorphologie auf. In Kooperation mit R. MUMM (Universität Wageningen, Niederlande) wurde in vorläufigen Studien gezeigt, dass die T-DNA-Insertionslinien verglichen mit dem Wildtyp eine geringere Attraktion auf den Parasitoid Cotesia rubecula ausüben (MUMM, unveröffentlicht).

Abbildung 4.4 Coronalon induzierte Expression von At1g61120 im Wildtyp und in zwei At1g61120-Insertionslinien

(A) Schematische Darstellung der Position der jeweiligen T-DNA Insertionen. Die Exons sind durch graue Boxen repräsentiert, während die Introns und die flankierenden Regionen durch eine schwarze Linie dargestellt sind. Schwarze Boxen symbolisieren die untranslatierten Bereiche des ersten und letzten Exons. Die zwei unabhängigen Insertionslinien sind als Box A und B gekennzeichnet.

(B) Northern-Blot-Analyse des At1g61120-Transkriptes in Wildtyp und T-DNA-Insertionslinien nach Applikation von 100 µM Coronalon über die Wurzeln hydroponisch angezogener Pflanzen. Blätter der induzierten Pflanzen wurden nach 30 h geerntet.

Die Sammlung der Volatilen im Wildtyp und in salk_039864 (Abbildung 4.5) zeigt, dass in den induzierten At1g61120-Insertionslinien die Terpene TMTT und GL komplett fehlen, obwohl eine Induktion von (E,E)-α-Farnesen und MeSA zu erkennen

A

5´ UTR T-DNA T-DNA

A B

salk_078187 (B) salk_039864 (A)

3´ UTR At1g61120

Actin Wt

salk_078187 salk_039864

B

ist. Eine Induktion unter gleichen Bedingungen im Wildtyp führt zu deutlicher Emission von TMTT und GL.

Abbildung 4.5 Coronalon induzierte Emission von Volatilen im Wildtyp (oben) und der At1g61120-Insertionslinie salk_039864 (unten)

Die Sammlung von Volatilen erfolgte von 21 bis 30 h nach Gabe von 100 µM Coronalon über die Wurzeln hydroponischer Pflanzen. MeSA: Methylsalicylat; TMTT: (E,E)-4,8,12-Trimethyltrideca-1,3,7,11-Tetraen; GL: Geranyllinalool; u: unidentifiziertes Terpen. Die gezeigten Chromatogramme sind für 93 m/z ausgewählt. Daten wurden von D. Tholl erfasst.

Die gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass At1g61120 eine Geranyllinalool-Synthase ist und dass das gebildete GL das Substrat für das Terpen TMTT darstellt.

Dies ist in guter Übereinstimmung mit dem vermuteten Mechanismus der TMTT-Synthese in der Lima-Bohne (BOLAND et al., 1998; GABLER et al., 1991). Weiterhin scheinen das Enzym für die TMTT-Synthese nicht redundant angelegt zu sein, da der Verlust von At1g61120-Transkript ausreicht, um die GL/TMTT-Produktion komplett zu unterbinden. Die fehlende Redundanz ist in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass es bis auf die Terpensynthasen für die Gibberelin-Biosynthese keine Gene mit

Abundanz x10³

2 6 10 14 18

MeSA

(E,E)-α-Farnesen salk_039864Coronalon

2 6 10 14 18

TMTT

GL u

Retentionszeit [min]

MeSA

(E,E)-α-Farnesen

Wt Coronalon

16.0 20.0 24.0 28.0 32.0

16.0 20.0 24.0 28.0 32.0

einer ausgeprägten Homologie zum Gen At1g61120 im Arabidopsis Genom gibt (AUBOURG et al., 2002).

4.1.4 Der Phänotyp der Insertionslinie kann durch ektopische Expression von