AtGLS ist in Blüten und Schoten sowie an Wundrändern exprimiert

t ist, Stabilität des negativen Regulators JA nötig ist. Dazu wurde die JA defiziente dde2- Mutante mit Cycloheximid behandelt. Wie Abbildung 4.18 zeigt, ist die Induktion mit Cycloheximid in der dde2-Mutante stark vermindert; dies lässt darauf schließen, dass für die Wirkung von COI1 die Anwesenheit eines Oxylipins (vermutlich JA) nötig ist.

Zusammenfassend kann man sagen, das die Cycloheximid induzierte Transkription ein funktionelles COI1-Protein und die Anwesenheit eines Oxylipins benötigt. Ein Modell, dass die hier gewonnen Ergebnisse berücksichtigt wird in 5.6 diskutiert.

Abbildung 4.18 AtGLS-Transkript-Analyse nach Behandlung von coi1- und dde2-Mutante sowie

(A) dde2-Mutanten sowie de

wurde Blattmaterial geerntet und das AtGLS-Transkript analysiert.

(B) coi1-Mutanten sowie der Wildtyp (Wt) wurden hydroponisch an

0,1% Ethanol-Lösung (EtOH) behandelt. Nach 6 h wurde Blattmaterial geerntet und das AtGLS-Transkript analysiert.

In 4.1.2 wurde gezeigt, dass die AtGLS in unbehandelten Blättern nicht exprimier aber dort durch verschiedene Elicitoren (Alamethicin, Coronalon, P. xylostella) induziert werden kann. In den folgenden Experimenten sollte ermittelt werden, ob es eine konstitutive Expression in anderen Organen (Blüte etc.) der Pflanze gibt.

Wt

Dazu wurde das Reportergen GUS unter der Kontrolle des AtGLS-Promotors exprimiert (AtGLS::GUS; siehe Abbildung 4.19). Um zu ermitteln, ob die wichtigsten regulatorischen Elemente in den für die Fusion ausgewählten 1162 bp des AtGLS- Promotors enthalten sind, wurden die transgenen Pflanzen mit den Induktoren Alamethicin und Cycloheximid behandelt und anschließend das endogene AtGLS- Transkript sowie das GUS-Transkript analysiert. Wie in Abbildung 4.19 zu sehen ist verhält sich das GUS-Transkript ähnlich wie das AtGLS-Transkript bezüglich der Induktion mit Alamethicin und Cycloheximid. Es ist also davon auszugehen, dass alle wichtigen regulatorischen Elemente innerhalb von 1162 Bp oberhalb der putativen AtGLS-Transkriptionsstartstelle liegen. Allerdings sieht man in den Ethanol behandelten Pflanzen geringe Mengen GUS-Transkript, während das AtGLS-Transkript nicht detektierbar ist. Es ist nicht auszuschließen, dass der AtGLS-Promotor auch in unbehandelten Pflanzen leicht aktiv ist. Allerdings ist bezüglich der AtGLS eine Akkumulation des Transkriptes im Gegensatz zum GUS-Transkript nicht zu beobachten, vermutlich da das AtGLS-Transkript deutlich instabiler als das GUS- Transkript ist.

Abbildung 4.19 GUS- und AtGLS-Transkript Mengen in AtGLS::GUS-Pflanzen (#14) nach Behandlung mit den Elicitoren Alamethicin (Ala) und Cycloheximid (CHX)

(A) Schematische Darstellung des AtGLS::GUS Konstruktes. Der AtGLS-Promotor (-1162 bis +3) wurde mit Hilfe der Gateway™ Technologie in den Vektor kloniert. Die attB2-Stelle ist Teil des 5´UTR vor dem GUS-Gen.

(B) GUS- und AtGLS-Transkript-Analyse in transgenen AtGLS::GUS-Pflanzen nach Induktion mit einer 5 µg/ml Alamethicin-Lösung (Ala), einer 20 µg/ml Cycloheximid-Lösung (CHX) oder mit einer 0,1%

Ethanol-Lösung (EtOH). Blattmaterial wurde nach 31 h geerntet.

Ala

AtGLS

Aktin EtOH

GUS

B

CHX

attB2 attB1

AtGLS promoter GUS

A

AtGLS::GUS

Abbildung 4.20 Histologische GUS-Färbung von einer Schote (1), einer Blüte (2), einem Blütenstand (3) und einem verwundeten Blatt (4), die von einer AtGLS::GUS-Pflanze (#14) entnommen wurden.

Das Blatt wurde mit einem Skalpell verwundet, die anderen Organe wurden unbehandelt in die Färbelösung überführt und für 8 h inkubiert. Die Entfernung des Chlorophylls erfolgte durch Waschen in 70% Ethanol. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens 10 unabhängige AtGLS::GUS-Linien

In einem weiteren Schritt wurden Schoten, Blüten und Blätter unabhängiger AtGLS::GUS-Linien einer histologischen GUS -Färbung unterzogen. Dabei zeigt eine Blaufärbung jene Bereiche an, in denen das GUS-Protein exprimiert wird und ein farbloses Substrat in ein blaues und unlösliches Produkt umsetzt. Wie Abbildung 4.20 zeigt, ist der AtGLS-Promotor in den Hüllblättern, an der Spitze der Narbe und in den Staubblättern exprimiert. In den jungen ungeöffneten Blüten findet sich noch keine Expression in den Hüllblättern, wohl aber in einem späteren Entwicklungsstadium. Die Schoten zeigen nur an der Spitze und an der Basis eine AtGLS-Expression. Die Expression in diesen Organen korreliert gut mit der TMTT-Emission in Blütenständen (CHEN et al., 2003b). Verwundete Blätter zeigen nur direkt an den Wundrändern eine Aktivität des AtGLS-Promotors. Verwundete Pflanzen zeigen keine messbare Induktion von TMTT und GL (THOLL, unveröffentlicht); vermutlich reichen die induzierten Mengen AtGLS nicht für eine messbare TMTT- bzw. GL-Produktion aus. Eventuell sind die Mengen von AtGLS an den Wundrändern auch deutlich geringer als die GUS-Färbung vermuten lässt, da zum einen das GUS-Transkript (s. o.) und evtl. auch das GUS-Protein deutlich stabiler sind als das AtGLS-Transkript bzw. Protein. Zum anderen

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ist an den Wundrändern die Zugänglichkeit des GUS-Enzyms zu seinem Substrat evtl.

erhöht und die enzymatische Reaktion amplifiziert ein ursprünglich schwaches Signal stark. Eine histologische GUS- Färbung kann deshalb nur eine Aussage über die Qualität, nicht aber über die Quantität der Expression machen. Die Verwundungs-Vermittelte AtGLS-Expression ist im Gegensatz zur Induktion mit Alamethicin (siehe 4.2.1) nicht vom COI1-Protein abhängig (siehe Abbildung 4.21).

Abbildung 4.21 Histologische GUS-Färbung verwundeter Blätter von AtGLS::GUS-Pflanzen im coi1- Hintergrund

AtGLS::GUS Pflanzen (Linie #14) wurden mit coi1-Mutanten gekreuzt und auf Homozygotie bezüglich des AtGLS::GUS Transgens selektiert. Diese Samen wurden auf Erde ausgelegt. Nach 3 Wochen wurden Blätter mit einem Skalpell verwundet und für 8 h in der Färbelösung inkubiert. Die Entfernung des Chlorophylls erfolgte durch Waschen in 70% Ethanol (oberer Teil der Abbildung). Nach 5 Wochen wurde ein weiteres Foto vom Blütenstand der Pflanze gemacht (unterer Teil der Abbildung). Die zu erkennende Sterilität ist indikativ für eine homozygot vorliegende coi1-Mutation (coi1/coi1), während es sich bei der fertilen Pflanze entweder um eine heterozygote coi1-Pflanze (coi1/wt) oder eine Pflanze ohne Mutation im coi1-Gen handelt (wt/wt). Eine nicht entwickelte Schote ist mit einem weißen Pfeil markiert.