Das AtGLS-Transkript weist einige Besonderheiten auf

Wie bereits in 4.1.4 erläutert, kam es in transgenen Pflanzen mit einem isolierten AtGLS-ORF (ohne Introns) unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors oder des Alkohol-induzierten AlcA-Promotors zu keiner Akkumulation des AtGLS- Transkriptes (Daten nicht gezeigt). Bei diesem Konstrukten handelte es sich um den isolierten ORF des AtGLS-Gens, der sich vom Start- bis zum Stop-Codon erstreckt;

durch die Klonierung in die jeweiligen Vektoren wurde der ORF mit einer heterologen 5´ und 3´ UTR versehen (siehe Abbildung 4.22). In dieser Form wurde der ORF auch für die Expression in der Hefe H. polymorpha verwendet, die nach Einführung des AtGLS-ORFs Transkript akkumulierte (siehe 4.1.4). Um die Funktionalität des Konstruktes mit dem isolierten AtGLS-ORF unter der Kontrolle des 35S-Promotors (35S::AtGLSORF) zu beweisen, wurde dieses Konstrukt in N. tabacum eingeführt.

AtGLS::GUS coi1/coi1 AtGLS::GUS coi1/wt; wt/wt

Abbildung 4.22 AtGLS-Transkript-Analyse in N. tabacum Pflanzen transformiert mit dem isolierten ORF der AtGLS unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors (35S::AtGLSORF).

(A) Schematische Darstellung des für die Transformation von N .tabacum verwendeten Konstruktes 35S::AtGLSORF. Der isolierte AtGLS-ORF ohne Introns mit 129 Bp einer heterologen 5´UTR und einem 35S-Terminator steht unter der Kontrolle des Blumenkohl Mosaik Virus Promotors (35S). Die Klonierung wurde über das Gateway ™ System durchgeführt, weshalb der ORF von attachment sites flankiert ist. Die graue Box symbolisiert den ORF, die weiße Box den 35S-Promotor und schwarze Boxen die attachment sites (attB1 und attB2), die graue Linie zeigt die Lage des 35S-Terminators an.

(B) Transgene N. tabacum (N. t.) Linien mit dem Konstrukt 35S::AtGLSORF wurden zu vollständigen Pflanzen herangezogen von denen Material für eine AtGLS-Transkript-Analyse geerntet wurde.

Dargestellt ist das Ergebnis einer Linie, deren Expression für sechs weitere Linien repräsentativ ist. Zum Vergleich wurde Blattmaterial einer untransformierten N. tabacum Pflanze (N. t.) und einer A. thaliana (A. t.) Pflanze (hydroponisch angezogen und für 31h mit 5 µg/ml Alamethicin behandelt) analysiert.

In Abbildung 4.22 sieht man, dass das Konstrukt mit dem konstitutiven Promotor im Gegensatz zu A. thaliana in N. tabacum zur Akkumulation eines Transkriptes führt. Das AtGLS-Transkript befindet sich nur in transformierten Pflanzen; es weist die gleiche Größe auf, wie das in A. thaliana induzierte Transkript. Das Konstrukt ist also vermutlich zumindest in N. tabacum funktionell. Vergleicht man das Konstrukt, das in A. thaliana zur konstitutiven Transkription der AtGLS führt (35S::AtGLS, siehe 4.1.5) mit dem Konstrukt, das nur in N. tabacum zur konstitutiven Expression führt, dann sieht man, dass der Unterschied in den Introns, der 5´ und 3´ UTR sowie in der 3´

flankierenden Region liegt. Der Vektor und der 35S-Promotor ist in beiden Fällen identisch. Dies weist darauf hin, dass die Transkription oder die Stabilisierung des Transkriptes in A. thaliana die Anwesenheit der 5´oder 3´UTR oder der Introns oder der 3´flankierenden Region benötigt.

35S::AtGLS_ORF

attB2 attB1

35S Promotor 35S::AtGLS_ORF

A

35S::AtGLS^O

RF

Wt Ala untransformiert

N.t. N.t. A.t.

B

AtGLS

28S rRNA

Abbildung 4.23 Analyse des AtGLS-Transkriptes in konstitutiven Expressionslinien (35S::AtGLS) nach Gabe von Alamethicin und Cycloheximid

Pflanzen transgener Expressionslinien (35S::AtGLS; #F, #R, #S, #W) wurden hydroponisch angezogen und über die Wurzeln mit einer 20 µg/ml Cycloheximid-Lösung (CHX) bzw. einer 5µg/ml Alamethicin-Lösung (Ala) oder einer 0,1% Ethanol-Alamethicin-Lösung (EtOH) behandelt. Nach 6 h wurde Blattmaterial der Cycloheximid-behandelten Pflanzen geerntet. Von den Alamethicin-behandelten Pflanzen wurde nach 6 und 31h Material geerntet und einer AtGLS-Transkript Analyse unterzogen.

Um die Theorie zu testen, dass es in A. thaliana Mechanismen gibt, die in Anwesenheit eines Induktors zur Stabilisierung des Transkriptes führen, wurden transgene A. thaliana-Linien (35S::AtGLS) im mit einer schwachen konstitutiven Expression der AtGLS aber ohne endogenes AtGLS-Transkript (salk_039864; siehe 4.1.3) ausgewählt und mit den Induktoren Alamethicin und Cycloheximid behandelt.

In Abbildung 4.23 ist zu erkennen, dass sich das Transkript durch Gabe von Alamethicin und Cycloheximid deutlich verändert. Allerdings ist diese Veränderung nicht in allen Linien konsistent. In Linie #F zeigt sich eine Zunahme des Transkriptes nach 31 h Alamethicin Behandlung oder Gabe von Cycloheximid, die anderen Linien verhalten sich eher gegenläufig. Die auffälligste Veränderung ist aber das Auftreten zusätzlicher Banden in allen Pflanzen, die mit Alamethicin oder Cycloheximid oder bei Linie #W mit Ethanol behandelt wurden. Dabei könnte es sich um Spaltungsprodukte des ursprünglichen Transkriptes handeln, da beide Signale kürzere Transkripte repräsentieren. Da es sich um distinkte Banden handelt (außer in #W) ist davon auszugehen, dass die Spaltung immer an der gleichen Stelle erfolgt. Eventuell verhalten sich die Linien alle etwas unterschiedlich aufgrund der Tatsache, dass in den Linien

AtGLS

jeweils andere Mengen des Transkriptes am Anfang der Behandlung vorlagen, die Schwellenwerte für die Aktivierung von Abbaumechanismen überschreiten.

Bemerkenswert ist, dass solche zusätzlichen Signale niemals aufgetreten sind, wenn der Wildtyp mit Cycloheximid oder Alamethicin induziert wurde (siehe z. B. 4.2.6). Es sind auch niemals zusätzliche Signale in unbehandelten ektopischen Expressionlinien (35S::AtGLS #1 und #2; siehe 4.1.5) beobachtet worden. Dies lässt darauf schließen, dass sich das durch die ektopische Expression erzeugte AtGLS-Transkript von dem endogenen unterscheidet. Beide Transkripte sind ähnlich groß und führen zur Expression des gleichen Proteins (siehe 4.1.5), evtl. liegt der Unterschied in einem Faktor, der an die mRNA bindet und deren Stabilisierung oder Degradation ermöglicht.

Dieser Unterschied äußert sich in der Degradation des ektopisch exprimierten Transkriptes im Gegensatz zum endogenen Transkript unter Stressbedingungen bzw.

einer bestimmten Expressionsstärke. Um diesen Unterschied und den damit verbundenen Mechanismus zu charakterisieren, sind weitere Analysen notwendig. Es wäre z. B. möglich, die für die Stabilisierung oder den Abbau notwendigen Sequenzen zu kartieren und in einem weiteren Schritt putative Proteine zu finden, die an diese Sequenzen binden.

4.2.9 Die effiziente Umsetzung von Geranyllinalool zu TMTT braucht ein