NAD+als Coenzym ist nicht nur an zahlreichen zellul¨aren Redoxreaktionen des Stoff-wechsels beteiligt, sondern es ist auch ein funktionelles Molek¨ul in vielen Aspek-ten des Lebens. Es wurde festgestellt, dass NAD+ eine entscheidende Rolle in der Calcium-Hom¨oostase[50], Zellproliferation[51], Alterung[52], Apoptose[53], kovalenten Protein Modifikation[54], Genexpression und Regulation zahlreicher NAD+-abh¨ angi-ger Emzyme[55] spielt. Die aktuellen Studien zeigen, dass NAD+ als Immunregula-tor[56] fungiert oder den Tod von T-Zellen[56] induzieren kann. Um seine Funkti-on in komplexen biologischen Prozessen zu erforschen, ist man auf unterschiedliche Modifikationen des Molek¨uls angewiesen. Allgemein kann das NAD+-Molek¨ul in der
Adenosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modi-fiziert werden (Abbildung 1.3.1).
Abbildung 1.3.1: Modifikationsm¨oglichkeiten des NAD+-Molek¨uls. Das Molek¨ul kann in der Ad-enosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modifiziert werden.
Um den molekularen Mechanismus der NAD+-beteiligten biochemischen Prozesse zu entschl¨usseln, wurden verschiedene modifizierte NAD+ in den aktuellen Untersu-chungen verwendet. Hirst et. al.[57] verwendete ein Wasserstoffisotop f¨ur die Detek-tion der ¨Ubertragung des Hydrid-Ions w¨ahrend der NADH Oxidation ¨uber NADH-Dehydrogenase. Obwohl die NADH-Dehydrogenase vor mehr als 50 Jahren erstmals gereinigt wurde[58], ist zum Mechanismus der Redox-getriebenen Protonentranslo-kation nur wenig bekannt[59]. Man weißt nicht, wie die Proton¨ubertragung zwischen der C4-Position des Nicotinamidrings und der N5-Position vom Flavinmononukleotid (FMN) erfolgt. Hirstet.al. bereitete dasR-NADD undS-NADD als NAD+-Analoga vor und f¨uhrte die Kinetikmessung des Oxidationsschritts durch. Aus gemessenen Experimentdaten wurde herausgefunden, dass die Reaktionsgeschwindigkeit von S -NADD im Vergleich vom NADH signifikant gesunken ist und deutlich ein prim¨arer kinetischer Isotopeneffekt hinwies. Es best¨atigte sich, dass die Hydrid¨ubertragung stereospezifisch von der pro-S Position des Nicotiamidrings aus stattfindet. Und zu-sammen mit der NAD+-Dissoziation sind beide zum Teil der geschwindigkeitsbe-stimmende Schritt f¨ur NADH Oxidation ¨uber NADH-Dehydrogenase[57]. Im ande-ren Fall berichtete Li et. al.[60] die Synthese und Evaluation der Azido- und Diazo-NAD+-Analoga in Photoaffinit¨atsmarkierungsexperimenten. Die Azidogruppe an der 2- bzw. 6-Position des Adenins kann leicht zu einem Tetrazol isomerisieren[61].
Des-halb wurden einige Modifikationen am Pyridinring von NAD+ angebracht. Eine von der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus der Leber katalysierten Redoxreaktion wurde als ein Modell f¨ur die Untersuchung der NAD+-Analoga eingesetzt. Die Erbenisse[60]
zeigten, dass die NAD+-Analoga die Coenzymaktivit¨at besaßen, wenn das Molekul die Carbonylgruppe enth¨alt. Es wurde darauf hingewiesen, dass die Carbonylgrup-pe in der Redoxreaktion eine wichtige Rolle f¨ur Bildung einer Wasserstoffbindung mit dem Enzym spielte. Die Subsitution vom α-Diazoketon bzw. Arylazido-Rest an der Carboxamidgruppe des Nicotinamids und die Azidogruppe an der 5-Position des Pyridinrings zeigten zwar keine Coenzymaktivit¨at, aber die Molek¨ule senkten die Re-aktionsgeschwindigkeit der Bildung von NADH, wenn das nat¨urliche NAD+ in der enzymatischen Reaktion vorhanden war. Solche Modifikationen k¨onnen als Inhibitor
¨ahnlich der Redoxreaktion angewendet werden.
Die NAD+-Analoga wurden nicht nur in der Untersuchung der Redoxreaktion ge-braucht, sondern sie hatten auch Anwendungsm¨oglichkeiten in der Forschung der ADP-Ribosylierung. Die Arbeitsgruppe von Lin hat berichtet, dass eine Propargyl-gruppe auf die 6-Position bzw. 8-Position des Adenosins[62] gebracht wurde und die erhaltenen NAD+-Analoga[62] in vitro getestet wurden. Mit Hilfe einer Click-Reaktion k¨onnen die auf Proteine ¨ubergetragenen ADPR-Einheiten und die entspre-chenden Proteine durch fluoreszierende Farbstoffe in SDS-Gel visuell dargestellt wer-den. Zuerst wurde diese Methode zur Untersuchung der ART-Aktivit¨at von Sirtui-nen[63]verwendet. Es wurde herausgefunden, dass das 6-Alkin-NAD+ein Substrat f¨ur die Deacetylierungsreaktionen ist und das 8-Alkin-NAD+ inaktiv war. Jedoch kann beim 6-Alkin-NAD+keine Aktivit¨at der Sirtuin-abh¨angige ADP-ribosylierung festge-stellt werden. Ein eventueller Grund liegt darin, dass die ADP-Ribosylierungsaktivit¨at von Sirtuinen nicht physiologisch relevant sein k¨onnte. Außerdem wurden vier m¨ ogli-che Mechanismen f¨ur Sirtuin-abh¨angige ADP-Ribosylierung aus den relativen Experi-mentdaten dargestellt. Linet.al.[64]fokussierte noch seine Untersuchungen mit Hilfe von 6- bzw. 8-Alkin-NAD+durch die Markierung und zur Identifizeirung der
entspre-chenden Substratproteine in der Poly(ADP-Ribos)ylierung. Durch die gleiche Metho-de kann er sowohl das ARTD1 selbst als auch anMetho-dere Proteine wie p53, RAP74(TFIIF-Untereinheit), TRF1, sowie mehrere mitochondrialen Proteine markieren. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann noch abgeleitet werden, dass das 8-Alkin-NAD+ auch kein effizientes Substrat f¨ur ARTD1 ist. Wahrscheinlich erzeugt die Alkinmodifika-tion auf der 8-PosiAlkinmodifika-tion des Adenosins die sterische Hinderung, wenn es an ARTD1 bindet[64]. Außerdem k¨onnen ¨uber 70 ADPR-markierte Substratproteine[64]aus dem ARTD1 niedergeschlagenen Zelllysat durch Biotin-Affinit¨atstag herausgefischt und separat identifiziert werden.
Außerdem wurden einige NAD+-Modifikationen als Inhibitor der NAD+-abh¨angigen Enzyme in verschiedenen Metabolismen verwendet. Durch Hemmung einer Aktivit¨at der beteiligten Enzyme konnte man schließen, welche Funktion NAD+ in diesem Fall besitzt. Ein Beispiel der NAD+-Modifikationen ist die spezifische Hemmung der NAD+-Glycohydrolaseaktivit¨at von CD38, das nach der HIV-Infektion h¨aufig als Marker bei der B- und T-Zellaktivierung verwendet wird (HIV-Monitoring)[65]. Wall et. al.[66] wollte wirksame und spezifische Inhibitoren verf¨ugen und versuchte dadurch zu ermitteln, wie die cADPR-Aktivit¨at mit der biologischen Funktion von CD38 in Zusammenhang steht. Das synthetisierte Carba-NAD+ und Pseudocarba-NAD+ wurden in das Enzymassay eingesetzt und es wurde aus gemessenen IC50 -Werte[66] festgestellt, dass das Pseudocarba-NAD+ eine signifikante Aktivit¨at zur Hemmung der einigen Enzyme, insbesondere zum menschlichen CD38 zeigte. Die Ergebnisse[66] wiesen darauf hin, dass die ungew¨ohnliche Stereochemie dieses Di-nukleotids eine hochspezifische Pyridin-Dinukleotid-Bindungsstelle in den sensitiven Enzymen beinhaltet und der Mechanismus der Hemmung die Bildung eines tern¨aren Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplexes ben¨otigt. Ein anderes Beispiel ist Synthese und Evaluation der C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylnicotinamid. Es wurde beschrie-ben, dass solche Analoga mit verschiedenen biologischen Wirkungen von Anti-Tumor-Aktivit¨aten ausstatten[67] und einige derzeit in klinischen Studien getestet sind[68].
Migaud et. al.[69] synthetisierte drei neuartige C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylni-cotinamid, um bestimmte Strukturmerkmale zur spezifischen Erkennung aufzuzeigen und die Enzym- und Zellselektivit¨at zu optimieren. Im Screening wiesen zwei β-NAD+-Analoga die selektive Hemmung der Dehydrogenaseaktivit¨at auf. Diese Wirk-samkeit ist von der Substitutionsstruktur eines Thiophenrings abh¨angig. Die effekti-ve Hemmung wird erzielt, wenn die Substitutionsgruppe als ein Wasserstoffbr¨ ucken-Akzeptor wirkt und sie die elektrostatische Wechselwirkung des Sauerstoff-Atoms in der Furanose kompensieren kann.
Aus einigen beschriebenen Bespielen wurde herausgefunden, dass NAD+ ein vielf¨ alti-ges Molek¨ul ist. Die durch Einf¨ugung der verschiedenen Funktionalit¨aten modifizier-ten NAD+-Molek¨ule sind ein erforderliches und sehr hilfreiches Werkzeug, das in den enzymtiachen Untersuchungen verwendet wird um eigene Funktionen des Mole¨uls live in lebenden Zellen w¨ahrend der DNA-Reparatur oder in anderen biologischen Pro-zessen zu beobachten und den Mechanismus der NAD+-beteiligten Reaktionen sowie neue biologische Signalwege, die durch bekannte oder neue NAD+-konsumierende Reaktionen reguliert sind, zu verstehen. Die herausgefundenen Resultate erm¨ ogli-chen ein breites Spektrum von Anwendungen in der weiteren Grundlagenforschung der chemischen Biologie und Medizin, der Medikamentenherstellung und der Krank-heitsbek¨ampfung.