Synthesen von NAD + -Analoga und ihre Anwendungen
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Yan Wang
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Tag der m¨ undlichen Pr¨ ufung: 25. Juni 2015
1. Referent/Referentin: Prof. Dr. Andreas Marx
2. Referent/Referentin: Prof. Dr. Valentin Wittmann
Teile dieser Arbeit sind ver¨ offentlicht
Y. Wang, D. R¨osner, M. Grzywa, A. Marx: Kettenterminierende und durch Click- Chemie modifizierbare NAD+-Analoga zur Markierung von Zielproteinen der ADP- Ribosyltransferasen, Angew. Chem., 2014, 126, 8298-8301; Chain-terminating and clickable NAD+analogues for labeling the target proteins of ADP-ribosyltransferases, Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 8159-8162.
Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2010 bis Juni 2014 im Arbeitskreis von Herrn Prof. Andreas Marx am Lehrstuhl f¨ur Organische und Zellul¨are Chemie im Fachbereich Chemie der Universit¨at Konstanz.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Andreas Marx f¨ur die Aufnahme in seinen Arbeitskreis, die ¨Uberlassung des sehr vielseitigen und interessanten Promotionsthe- mas, die hervorragende wissenschaftliche Betreuung in jeder Phase der Arbeit sowie f¨ur die zahlreichen sachkundigen und richtungsweisenden Anregungen.
Bedanken m¨ochte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann f¨ur die ¨Uber- nahme des Zweitgutachtens und Herrn Prof. Dr. Gerhard M¨uller f¨ur die ¨Ubernahme des Pr¨ufungsvorsitzes.
An dieser Stelle m¨ochte ich mich bei allen jetzigen und fr¨uheren Mitgliedern der Arbeitsgruppe f¨ur die unterhaltsame Zeit, die gute Arbeitsatmosph¨are und die Hilfs- bereitschaft bedanken. In diesem Zusammenhang m¨ochte ich besonders meinen La- borkollegen Anna-Lena Steck, Meike Liebmann, Meng Zheng f¨ur die unkomplizierte Zusammenarbeit, die sch¨one und lustige Zeit im Labor und die vielen wissenschaft- lichen Gespr¨ache danken, Xiaohui Zhao und Sarah Wallrodt f¨ur die sehr anregenden Gespr¨ache ¨uber Forschung und Science Fiction.
Außerdem m¨ochte ich Daniel R¨osner f¨ur die Unterst¨utzung bei meinen biochemischen Experimenten danken, Anna-Lena Steck und Holger Bußkamp f¨ur die Aufnahme der hochaufl¨osenden Massenspektren. Mein Dank gilt weiterhin Karin Lanz-Schwarz, To- bias Strittmatter und Sarah Wallrodt f¨ur das Korrekturlesen dieser Dissertation.
Anke Friemel und Ulrich Haunz danke ich f¨ur die Aufnahme zahlreicher NMR- Spektren.
All meinen Freunden und Bekannten im Fachbereich Chemie danke ich f¨ur viele un- vergessliche und lustige Momente.
Ich m¨ochte mich ganz besonders bei meinen Eltern bedanken. Ohne ihre Unterst¨utz- ung und den bedingungslosen Familienr¨uckhalt w¨are es nicht m¨oglich gewesen, diese Arbeit zu beenden.
Nicht zuletzt m¨ochte ich mich bei meiner Ehefrau Jingjing Han bedanken, die in jeder Situation Frustration und Gl¨uck mit mir teilt.
Abstract
Based on its diverse functions, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is well known to participate in a variety of cellular processes, such as redox metabolism, signaling pathways, and post-translational modifications. In 1963 Chambon et. al.
reported for the first time about the formation of a nucleic acid like polymer derived from NAD+, now referring to us as poly(ADP-ribose) (PAR). ADP-ribosylation is a reversible post-translational modification of proteins, catalyzed by a family of enzy- mes termed ADP-ribosyltransferases (ARTs), formerly known as poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs). ARTs play important roles in a wide range of biological pro- cesses, including DNA repair, maintenance of genomic stability and transcriptional regulation. ADP-ribosylation comprises the transfer of a single or multiple ADP- ribose moieties from NAD+ to a specific amino acid residues on a target protein, referring to us as mono(ADP-ribosyl)ation or poly(ADP-ribosyl)ation respectively.
In this process, the covalent transfer onto glutamic acid, aspartic acid (forming an ester bond) or lysine residues (forming a Schiff base) of target proteins is described.
To further investigate the functions of ADP-ribosylation and determine the crosstalk with other post-translational modifications, the identification of ADP-ribose acceptor site is crucial. Mass spectrometry based approaches for the identification of acceptor sites turned at to be a challenging task, because of the complex structure of attached PAR.
Encouraged by current research results, the toolbox of NAD+ analogues were ex- panded by designing and synthesizing NAD+ analogues. New NAD+ analogues are described in this thesis that are efficiently incorporated by wild-type ARTs and a) bear an affinity tag that will allow subsequent manipulations such as labeling and sample enrichment and b) lead to PAR chain termination owing to a lack of the re- quired hydroxyl group. Since little is known about the substrate scope of ARTs, the five novel NAD+ analogues 1-5were successful synthesized and applied in enzymatic
studies, and were found to be efficient substrates for ARTD1 and were used to label ADP-ribosylated ARTD1 and histone H1.2.
The synthesis of the analogues 1-5 was conducted by first synthesizing the modified adenosine cores 10, 15, 39, 41 and 49, which bear an iodine atom at the nucleoba- se. The synthesis of these compounds started from commercially available starting material 6, 11, 28, 33 and 42 respectively. The alkyne function was then introdu- ced with the Sonogashira reaction to yield 17, 18, 50-52, which were subsequently converted into the monophosphates 19, 20, 53-55. The respective monophosphates were subsequently converted into the NAD+analogues1-5by coupling with activated β-nicotinamide mononucleotide 25. In addition, the fluorescent dye 27, which was
required in the following biochemical experiment, was synthesized from sulfo-Cy5- NHS-ester26 and 3-azido-1-propanamine with good yields. The required affinity tag 58 was synthesized from D-(+)-biotin and an azido linker.
The obtained results of the biochemical experiments showed that the modified NAD+ 1 had been accepted by the ARTD1 much better than the 2 in the trans(ADP- ribos)ylation of histone H1.2 as well as in the auto(ADP-ribos)ylation of ARTD1. By the systematic modification of the hydroxy groups of adenosine, it was that explored the substrate scope of ARTD1 in terms of its dependence of the presence of a 200- and 300-OH group in the assembly of PAR. Whereas 1 led to the formation of long PAR, 4 and 5 act as chain terminators when applied in trans- or auto(ADP-ribos)ylation reactions. This confirms the need for the 200-OH for PAR formation and shows that the absence of this group cannot be rescued by the presence of a 300-OH. Furthermore it was found that the 300-OH group participates in the ADP-ribosylation catalysed by ARTD1 since the employment of 3leads to less efficient PAR formation as compared to the reactions where an analogue with both 200- and 300-OH groups (1) was employ- ed. It was further found that the modifications carried within5 turn this component into an efficient chain terminator of PAR synthesis that competes with natural NAD+
in ADP-ribosylation reactions. This study provides insight into the substrate scope of ARTD1 and its catalytic mechanism for trans- or auto(ADP-ribos)ylation. Further- more, the herein described NAD+ analogues 1, 3-5 could be added to the currently limited toolbox of NAD+ analogues for studying ADP-ribosylation processes. The alkyne modified chain-terminating analogues should facilitate the identification and analysis of target proteins of ADP-ribosylation in proteomics approaches, since first results of labeling histone H1.2 in the context of an in vitro pull-down assay are very promising, and should thus spur progress towards the development of new chemical tools to elucidate the metabolism of PAR.
Inhaltsverzeichnis
1 Einf¨uhrung 1
1.1 NAD+ . . . 1
1.1.1 Redoxfunktion von NAD+ . . . 2
1.1.2 Nicht-Redoxfunktion von NAD+ . . . 3
1.1.3 Biosynthese von NAD+ . . . 6
1.2 Bioorthogonale Chemie und Modifikationen von NAD+ . . . 7
1.2.1 Bioorthogonale Chemie . . . 7
1.2.2 Click-Reaktion . . . 8
1.2.3 Staudinger-Ligation . . . 10
1.3 Modifikationen von NAD+ . . . 12
1.4 ARTD1 und Poly(ADP-Ribos)ylierung . . . 16
1.4.1 ARTD1 . . . 17
1.4.2 Poly(ADP-Ribose) . . . 19
1.4.3 Poly(ADP-Ribos)ylierung und ihr Mechanismus . . . 20
1.4.4 Identifikation der spezifischen ADPR-Akzeptorstellen . . . 23
1.5 ARTD1 und DNA-Reparatur . . . 25
1.5.1 Uberblick ¨¨ uber ARTD1 und DNA-Reparatur . . . 25
1.5.2 Einfluss von ARTD1 in Basenexzisionsreparatur und Einzel- strangbr¨uchen . . . 27
1.5.3 Einfluss von ARTD1 in der Doppelstrangbruchreparatur . . . 30
1.6 ARTD1 Inhibitoren . . . 33
1.6.1 ARTD1 Inhibitoren und ihre Entwicklung . . . 33
1.6.2 Anwendungen der ARTD1 Inhibitoren . . . 35
2 Aufgabenstellung 39 3 Ergebnisse und Diskussion 41 3.1 Synthese vom C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . . 42
3.1.1 Syntheseplanung . . . 42
3.1.2 Ergebnisse der Synthese . . . 43
3.2 Synthese des Azido-Fluoreszenzfarbstoffs . . . 47
3.3 Biochemische Experimente der C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . . 48
3.3.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga . . . 49
3.3.2 ADP-Ribosylierung vom C2- oder C7-modifizierten NAD+ . . 50
3.4 Synthese der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ . . . 53
3.4.1 Syntheseplanung . . . 53
3.4.2 Ergebnisse der Synthese . . . 54
3.5 Synthese des Azido-Biotins . . . 58
3.6 Biochemische Experimente der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ 59 3.6.1 Spektroskopische Eigenschaften der NAD+-Analoga . . . 59
3.6.2 ADP-Ribosylierung der C2-modifizierten desoxygenierten NAD+ 60 3.6.3 Kompetition von NAD+-Analoga mit dem nat¨urlichen NAD+ 65 3.7 Pulldown-Experimente unter Anwendung des Kettenterminators . . . 67
3.7.1 Strategie der Pulldown-Experimente . . . 67
3.7.2 Ergebnisse der Pulldown-Experimente . . . 69
4 Zusammenfassung und Ausblick 75 5 Experimenteller Teil 80 5.1 Materialien und Ger¨ate . . . 80
5.1.1 Chemikalien . . . 80
5.1.2 L¨osungsmittel . . . 80
5.1.3 Pr¨aparative S¨aulenchromatographie . . . 81
5.1.4 D¨unnschichtchromatographie (DC) . . . 81
5.1.5 Ionenaustauschchromatographie (IEX) . . . 81
5.1.6 Mitteldruckfl¨ussigkeitschromatographie (MPLC) . . . 82
5.1.7 Massenspektrometrie . . . 82
5.1.8 NMR-Spektren . . . 82
5.1.9 Verbrauchsmaterial f¨ur die molekularbiologischen Arbeiten . . 83
5.1.10 Ger¨ate f¨ur die molekularbiologischen Arbeiten . . . 83
5.1.11 Enzyme . . . 84
5.2 Reagenzien und Puffer . . . 85
5.2.1 Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB)-Puffer . . . 85
5.2.2 Puffer und L¨osungen f¨ur den molekularbiologischen Teil . . . . 85
5.3 Chemische Synthese . . . 88
5.3.1 20,30,50-Tri-O-acetylguanosin . . . 88
5.3.2 2-Amino-6-chlor-9-[(20,30,50-tri-Oacetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin 89 5.3.3 6-Chlor-2-iod-9-[(20,30,50-tri-O-acetyl)-β-D-ribofuranosyl]purin 90 5.3.4 2-Iodadenosin . . . 91
5.3.5 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-bezoyl-D-ribose . . . 93
5.3.6 4-Chlor-5-iod-7-[(20,30,50-tri-O-benzoyl)-β-D-ribofuranosyl]-7H- pyrrol[2,3-d]pyrimidin . . . 95
5.3.7 7-Iod-7-deazaadenosin . . . 96
5.3.8 2-Ethinyladenosin . . . 98
5.3.9 7-Ethinyl-7-deazaadenosin . . . 99
5.3.10 2-Ethinyladenosin-50-monophosphat . . . 100
5.3.11 7-Ethinyl-7-deazaadenosin-50-monophsphat . . . 101
5.3.12 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribose . . . 102
5.3.13 3-(Carbamoyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-Dribofuranosyl)pyridini- umtriflat . . . 104
5.3.14 3-(Ethoxycarbonyl)-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)py-
ridiniumtriflat . . . 105
5.3.15 2A-Ethinyl-NAD+ . . . 107
5.3.16 7DA-Ethinyl-7-deazaNAD+ . . . 108
5.3.17 3-Azidopropyl-1-amino-sulfocyanin 5 (Sulfo-Cy5-Azid) . . . . 109
5.3.18 N2, 9-Diacetylguanin . . . 110
5.3.19 2-Amino-6-chlorpurin . . . 111
5.3.20 9-Acetyl-2-amino-6-chlorpurin . . . 112
5.3.21 6-Chlor-2-iodpurin . . . 113
5.3.22 1,2-O-Isopropyliden-5-O-(4-methybenzoyl)-α-D-xylofuranose . 114 5.3.23 3-Deoxy-1,2-O-isopropyliden-5-O-(4-methylbenzoyl)-α-D-ribo- furanose . . . 115
5.3.24 3-Deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofuranose . . . 116
5.3.25 1,2-Di-O-acetyl-3-deoxy-5-O-(4-methylbenzoyl)-α,β-D-ribofur- anose . . . 118
5.3.26 6-Chlor-2-iod-9-[(20-O-acetyl-30-deoxy-50-O-(4-methylbenzoyl)-β- D-ribofuranosyl]purin . . . 119
5.3.27 2-Iod-30-deoxyadenosin . . . 120
5.3.28 6-Chlor-2-iod-9-[20-deoxy-30,50-di-O-(4-methylbenzoyl)-β-D-rib- ofuranosyl]purin . . . 121
5.3.29 2-Iod-20-deoxyadenosin . . . 123
5.3.30 20-Deoxy-30,50-di-O-acetylguanosin . . . 124
5.3.31 2-Amino-6-chlor-9-[(30,50-di-O-acetyl-20-deoxy)-β-D-ribofuranos- yl]purin . . . 125
5.3.32 2-Amino-6-chlor-9-(20-deoxy-β-D-ribofuranosyl)purin . . . 126
5.3.33 2-Amino-6-chlor-9-[20-deoxy-50-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D- ribofuranosyl]purin . . . 127
5.3.34 2-Amino-6-chlor-9-[20,30-dideoxy-50-O-(tert-butyldimethylsilyl)- β-D-ribofuranosyl]purin . . . 128
5.3.35 6-Chlor-2-iod-9-[20,30-dideoxy-50-O-(tert-butyldimethylsilyl)-β-D-
ribofuranosyl]purin . . . 130
5.3.36 2-Iod-20,30-dideoxyadenosin . . . 131
5.3.37 2-Ethinyl-30-deoxyadenosin . . . 132
5.3.38 2-Ethinyl-20-deoxyadenosin . . . 133
5.3.39 2-Ethinyl-20, 30-dideoxyadenosin . . . 134
5.3.40 2-Ethinyl-30-deoxyadenosin-50-monophosphat . . . 135
5.3.41 2-Ethinyl-20-deoxyadenosin-50-monophosphat . . . 136
5.3.42 2-Ethinyl-20,30-dideoxyadenosin-50-monophosphat . . . 137
5.3.43 2A-Ethinyl-300-deoxy-NAD+ . . . 138
5.3.44 2A-Ethinyl-200-deoxy-NAD+ . . . 139
5.3.45 2A-Ethinyl-200,300-dideoxy-NAD+ . . . 140
5.3.46 1,2-Bis(2-azidoethoxy)ethan . . . 141
5.3.47 N-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethyl)biotinylamid . . . 142
5.4 Methoden . . . 144
5.4.1 Enzymatische Reaktionen . . . 144
5.4.1.1 Ubersicht der verwendeten Protein- und DNA-Sequenz 144¨ 5.4.1.2 ADP-Ribosylierung von Histon H1.2 . . . 144
5.4.1.3 Automodifikation von ARTD1 . . . 145
5.4.2 Proteinbiochemische Methoden . . . 145
5.4.2.1 Click-Reaktion von modifizierten Proteinen . . . 145
5.4.2.2 SDS-PAGE Gelelektrophorese . . . 145
5.4.2.3 Coomassie-F¨arbung von SDS-PAGE Gelen . . . 146
5.4.2.4 Western-Blot von Proteinen auf PVDF-Membranen . 146 5.4.2.5 Detektion mittels Streptavidin-alkalischer Phosphatase 147 5.4.3 Pulldown-Experiment unter Anwendung des Kettenterminators 148 5.4.3.1 Bruch der Biotin-Streptavidin-Interaction . . . 148
5.4.3.2 Spaltung der Phosphodiesterbindung . . . 149
5.4.3.3 Aminolyse der Esterbindung . . . 149
5.4.3.4 Pulldown-Experiment von Histon H1.2 . . . 151
6 Abk¨urzungsverzeichnis 152
7 Literaturverzeichnis 159
Kapitel 1 Einf¨ uhrung
1.1 NAD
+Im Jahr 1906 wurde von Harden und Young[1] das Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) im Zuge von Studien zur alkoholischen G¨arung in Hefeextrakten entdeckt und stellt somit das erstbeschriebene Coenzym dar. Aufgrund der chemischen Struk- tur, geh¨ort NAD+ zur Verbindungsklasse der Pyridinnukleotiden. In den 1920iger Jahren konzentrierten sich die Forscher auf das Gebiet der Coenzyme. Von Euler gelang es 1931 NAD+ aus Hefeextrakten zu isolieren und er kl¨arte auf, dass es sich struktur-chemisch um ein Pentosenukleosid handelt. Wenig sp¨ater konnte er zeigen, dass sich NAD+ aus den beiden Mononukleotiden Adenosinmonophosphat (AMP) und Nicotinamidmononukleotid (NMN) mit dem pyridin¨ahnlichen Nicotinamid (NA) zusammensetzt. Beide Mononukleotide sind durch ein Pyrophosphat miteinander ver- kn¨upft[2]. Die Redoxaktivit¨aten der Pyridinnukleotide wurde zuerst von Warburg und Christian[3] im Jahr 1935 beschreiben. Anhand der Reduktion des Acetaldehyds zu Ethylalkohol wurde gezeigt, dass NAD+ in Elektronen¨ubertragungsreaktionen in- volviert ist. Am Pyridin von NAD+ findet die eigentliche Wasserstoff- bzw. Elek- tronen¨ubertragung statt[3]. Fast der gesamte Fokus des Interesses richtete sich das letzte Jahrhundert hindurch auf Dinukleotide mit ihren reduzierten Formen (NADH und NADPH) und ihre Beteiligung an zahlreichen Redoxreaktionen des Stoffwech-
sels der Zelle. Als immer mehr zellul¨are Geheimnisse durch wissenschaftliche For- schung enth¨ullt wurden, stellte sich heraus, dass NAD+ nicht nur als Redoxcoen- zym fungiert, sondern auch weitere wichtige Funktionen in der Zelle hat. So wurde in den sp¨aten 60iger Jahren die zweite Hauptfunktion von NAD+ entdeckt, wobei ADP-Ribose (ADPR) an zellul¨are Nukleophile, wie z.B. pos-translational an Prote- ine ¨ubertragen wird[4]. Diese
”neue“ Chemie der NAD+ ist vielf¨altig und hat sich auf S¨auger-Organismen erweitert. Heute sind 18 ADP-Ribosyltransferasen[5] (ARTs, fr¨uher bekannt als Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen oder PARPs) und 7 Sirtuine[6]
bekannt, die unter Nutzung dieser Chemie in die verschiedene Signal¨ubertragungen und die Zellanpassung involviert sind.
1.1.1 Redoxfunktion von NAD
+Es ist bekannt, dass NAD+eine direkte Rolle im Katabolismus spielt. NAD+beteiligt sich als Co-Substrat in mehreren Schritten der Glykolyse[7], in der Lactat-Pyruvat- Umwandlung und der Pyruvat-Oxidation zu Acetyl-CoA durch Katalyse des Pyruvat- Dehydrogenase-Komplexes[7], im Citratcyclus[7]und als Elektronendonor zur NADH- Dehydrogenase (Komplex I) in der Atmungskette[7].
Die Redoxeigenschaften von NAD+ (Abbildung 1.1.1.1) resultieren aus dem Man- gel in der Elektronendichte in dem Nicontinamid-Ring. Wenn zur Ribose konjugiert, wird der Elektronenmangel durch Quaternarization des Pyridin-Stickstoffs im He- terocyclus akzentuiert. Diese quart¨are Pyridin-Gruppe wird noch mehr durch den Elektronenmangel des Carboxamids, was bekanntlich eine gute elektronenziehende Gruppe darstellt, stabilisiert. Der Elektronenmangel des Pyridin-Rings stellt eine treibende Kraft f¨ur die Aufnahme des Hydrid-Ions (ein Proton und zwei Elektronen) in der C4-Position dar. Die zwei Elektronen werden beim Angriff auf das C4-Atom des Rings aufgenommen, wobei der Stickstoff und daspara-st¨andige Kohlenstoffatom reduziert und das aromatische System aufgehoben wird. Die R¨uckreaktion wird hin-
gegen durch die Wiederherstellung der Aromatizit¨at angetrieben. Diese Redoxchemie spiegelt die genaue Bilanz zwischen Aufnahme und Entfernung des Hydrid-Ions wie- der. Diese Redoxreaktionen sind in der Regel reversibel, so dass es dabei nicht zu einem Nettoverbrauch des Coenzyms kommt.
Abbildung 1.1.1.1: Struktur der oxdierten und reduzierten Form von NAD+ und der zugeh¨orige Redoxreaktionsmechanismus.
Denn NAD+ und seine reduzierte Form NADH sind als Redox-Coenzyme an nahe- zu jeder Stoffwechselreaktion, die in Zellen zur Umwandlung von chemischen Stoffen durchgef¨uhrt wird, beteiligt. Deshalb stehen die beiden an einer Schl¨usselposition des Stoffwechsels. Dabei ¨ubernehmen die beiden unterschiedliche Funktionen. Bei S¨augern ist NAD+ f¨ur die Aufnahme von Elektronen in Energiestoffwechselwegen[8]
zust¨andig. Die Reduktionsenergie des NADH beg¨unstigt die Ausbildung eines Proto- nengradienten[8] uber die innere Mitochondrienmembran und wird zur Synthese von¨ ATP[8]genutzt. Um das NADH gen¨ugend zu erzeugen, ist das Verh¨altnis von NAD+ zu NADH in den meisten Geweben erh¨oht, sodass eine NAD+-Reduktion beg¨unstigt wird[8].
1.1.2 Nicht-Redoxfunktion von NAD
+NAD+ ist ein Elektrophil und der Ribose-Ring wird ¨uber das anomere Kohlenstof- fatom am Nicotinamid in NAD+ konjugiert. Deshalb kann es durch eine Vielzahl von zellul¨aren Nukleophilien, inklusive Proteinen, angegriffen und die ADPR-Einheit
anschließend auf Nukleophile ¨ubertragen werden (Abbildung 1.1.2.1). Diese ADPR- Ubertragung wird durch die Eigenschaft des Nicontinamids als gute Abgangsgruppe¨ erleichtert. Es gibt mehrere Enzymklassen[9], die NAD+ als Co-Substrat verwenden bzw. unter NAD+ Verbrauch diverse Reaktionen katalysieren. Dabei findet je nach der Art des Enzyms eine Poly(ADP-Ribos)ylierung oder Mono(ADP-Ribos)ylierung statt. Die vielf¨altigen NAD+-konsumierenden Enzyme haben vor kurzem großes In- teresse wegen ihrer wichtigen biologischen Funktionen hervorgerufen. Es wurde ver- mutet, dass die ADPR- ¨Ubertragungsreaktion eine grundlegende Bedeutung f¨ur die Modellierung der S¨augetierphysiologie[10] hat.
Abbildung 1.1.2.1: ADPR- ¨Ubertragungsreaktion von NAD+ auf ein zellul¨ares Nukleophil.
Neben diesen verschiedenen ADPR- ¨Ubertragungsreaktionen wurde k¨urzlich eine neue Modifikationsreaktion entdeckt: die NAD+-abh¨angige Proteindeacetylierung[11]. Bei dieser Reaktion wird O-Acetyl-ADP-Ribose (OAADPR) durch die Deacetylierung von acetylierten Lysinen in Histonen[12] erzeugt (Abbildung 1.1.2.2).
Abbildung 1.1.2.2: Struktur von OAADPR und sein Reaktionsmechanismus.
Jedoch ist die physiologische Relevanz der ¨Ubertragung der Acetylgruppe auf AD- PR weitgehend unbekannt. Es wurde vermutet, dass es sich bei OAADPR um ein neues Signalmolek¨ul handeln k¨onnte. Aktuellen Ergebnisse[13] zeigen jedoch, dass OAADPR in Genregulation zu einer Hemmung, Steuerung eines Ionenkanals und Redoxregulation dienen k¨onnte. Außerdem k¨onnte das Molek¨ul noch eine zentrale Rolle in der Biologie von Sirtuin[13] spielen.
Eine weitere wichtige Reaktionsart ist die Cyclisierung von NAD+ und die Reaktion liefert die cyclische ADPR (cADPR). Das Molek¨ul wurde zuerst im Jahr 1987 bei der Inkubation von NAD+ mit Seeigeleierhomogenaten[14] entdeckt und 7 Jahren sp¨ater konnte seine Struktur[15] ermittelt werden.
Abbildung 1.1.2.3: Schematische Darstellung der Bildung von cADPR.
Die cADPR wird aus NAD+ durch CD38[16], ein Enzym der Familie der ADP- Ribosyl-Cyclasen (ADPRC)[17], synthetisiert (Abbildung 1.1.2.3). Obwohl CD157 auch zur Familie der ADPRC geh¨ort, konnte nur eine sehr schwache Cyclaseakti- vit¨at[18]nachgewiesen werden. Die cADPR wird durch Cyclisierung von NAD+ unter Freisetzung von Nicotinamid gebildet. Dabei wird das Nicotinamid abgespalten und eine N-glycosidische Bindung zwischen dem Adeninring und der Ribose gebildet[19]. Als sekund¨arer Botenstoff ist die cADPR f¨ur die Ca2+-Signalgebung[20] verantwort- lich.
1.1.3 Biosynthese von NAD
+Sowohl vom biochemischen als auch strukturellen Standpunkt ist die NAD+-Bio- synthese eines der am besten untersuchten Stoffwechselwege. Je nach Organismus k¨onnen drei verschiedene Bausteine (Chinolins¨aure, Nicotins¨aure und Nicotinamid) f¨ur die NAD+-Biosynthese[21]verwendet werden. Chinolins¨aure ist der Ausgangsstoff f¨ur diede novo Synthese. In Eukaryoten wird normalerweise von Tryptophan ausge- gangen, w¨ahrend in Bakterien NAD+ aus L-Aspartat und Dihydroxyacetonphosphat synthetisiert wird. Im anderen Fall kann NAD+ ausgehend von Nicotins¨aure und Nicotinamid, die durch die verschiedenen Abbau- und Verbrauchsreaktionen im zahl- reichen zellul¨aren Metabolismus aus NAD+ und NADP+ erzeugt werden, erhalten werden (Abbildung 1.1.3.1[22]).
Abbildung 1.1.3.1: Schematische Darstellung der NAD+-Biosynthese[22]. (a) Chemische Struktur von NAD+ und seinen Derivaten. (b) Schematische Darstellung der biochemischen Prozesse der NAD+-Biosynthese.
Zuerst werden Chinolins¨aure, Nicotins¨aure und Nicotinamid durch geeignete Phos- phoribosyltransferasen[23] in Nicotins¨auremononukleotid oder NMN verwandelt. En-
zyme dieser Klasse k¨onnen die Phosphoribosyl-Einheit von Phosphoribosylpyrophos- phat (PRPP) in ihre spezifischen Substrate ¨ubertragen. Dann wird die Umwandlung der erhaltenden Molek¨ule in entsprechende Dinukleotide durch von Mononukleotid- Adenylyltransferasen[24]katalysierte Adenylierungsreaktion durchgef¨uhrt. Schließlich katalysiert die NAD+-Synthase die Amidierung. Dadurch wird NAD+ aus Nicotin- s¨aureadenindinukleotid erzeugt.
Trotz der intensiven Untersuchung sind die verschiedenen Wege der NAD+-Synthese z.B. bei S¨augern nur noch allgemein zu verstehen und k¨onnen in der Natur durch viele Faktoren beeinflusst werden. Deshalb werden verschiedene NAD+-Analoga als maßgeschneiderte Werkzeuge f¨ur weitere Untersuchungen ben¨otigt.
1.2 Bioorthogonale Chemie und Modifikationen von NAD
+1.2.1 Bioorthogonale Chemie
Seit langem wollten Forscher Biomolek¨ule in ihrer nat¨urlichen Umgebung untersu- chen. Jedoch ist diese Aufgabe wegen der enormen Komplexit¨at zellul¨arer Syste- me sehr anspruchsvoll, bis Bertozzi et. al.[25] erst vor Kurzem die bioorthogonale Chemie[26]signifikant weiter entwickelte. Die bioorthogonale Chemie bezieht sich auf jede chemische Reaktion, die mit einem biologischen System weder eine Wechselwir- kung eingehen noch eine St¨orung auftreten kann. Die teilnehmenden funktionellen Gruppen m¨ussen hochselektiv und rasch unter biokompatiblen Bedingungen mitein- ander reagieren k¨onnen und nicht toxisch f¨ur Zellen und Organismen sein. Genetisch verschl¨usselte Peptidmarker (z.B. das gr¨un fluoreszierende Protein, GFP[27]) werden wegen umf¨anglicher Anwendung und außergew¨ohnlicher Bedeutung nun h¨aufig in der Proteinforschung verwendet. Jedoch sind viele andere Biomolek¨ule wie Nukleins¨aur-
en, Lipide und Glycane sowie post-translationale Modifikationen (PTM) mit diesen genetisch codierten Markern nicht zug¨anglich und k¨onnen nicht beobachtet werden.
Uber die Jahre wurden mehrere ortsspezifische und bioorthogonale Methoden¨ [28]zur kovalenten Bindung von Fluoreszenzsonden oder Affinit¨atsmarkern an unterschiedli- chen Biomolek¨ulen entwickelt.
1.2.2 Click-Reaktion
Die in vielen bioorthogonalen Reaktionen am h¨aufigsten verwendete Reportergrup- pe ist die Azidgruppe[29]. Wegen seiner Eigenschaften wie z.B. chemisch inert und stabil unter physiologischen Bedingungen sowie nicht Vorkommen in biologischen Systemen[30] ist das Azid ein besonders vorz¨uglicher chemischer Reporter. Trotz die- ser tauglichen Eigenschaften konnte es in biologischen Systemen jedoch keine An- wendungsm¨oglichkeit finden, bis ein zweckm¨aßiger Reaktionspartner f¨ur das Azid entwickelt wurde.
Eine Reaktionsm¨oglichkeit f¨ur das Azid ist seine Beteiligung an der 1,3-dipolaren Cycloaddition[31]. Zwar wurde diese Reaktion zum ersten Mal im sp¨aten 19. Jahrhun- dert beschrieben[31], jedoch konnte der Reaktionsmechanismus erst durch Huisgen[32]
in den 60er Jahren erkl¨art werden. Wegen der f¨ur die Reaktion ben¨otigt hohen Tem- peraturen oder Dr¨ucke hat man an Verwendungen dieser Cycloaddition in zellul¨aren Umgebungen sowie in lebenden Systemen nicht gedacht. Seit das Konzept der Click- Reaktion 2001 von Sharplesset. al.[33] begr¨undet wurde, wurde eine neue T¨ur in der Chemie und Biologie ge¨offnet. Mit der Click-Reaktion k¨onnen zielgerichtete Zielmo- lek¨ule schnell, stereospezifisch und unter einfachen Reaktionsbedingungen und hoher Ausbeute aus kleineren Einheiten synthetisiert werden. Eine bedeutende Reaktion dieses Bereichs ist die kupfer(I)-katalysierte 1,3-dipolare Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC)[34]. Der beschriebene Mechanismus[35]der CuAAC ist in Abbildung 1.2.2.1 zu sehen.
Abbildung 1.2.2.1: Der Mechanismus der CuAAC.
Der Cu(I)-Katalysator koordiniert vor allem das Alkin und das Azid. Die Koordi- nation verringert pKs-Wert des Alkins[35] und aktiviert das Azid f¨ur nukleophilen Angriff[35]. Im n¨achsten Schritt f¨uhrt der Stickstoff im Azid einen nukleophilen An- griff auf das Alkin aus und ein Metallcyclus wird gebildet. Nach Entstehung eines Triazolrings wird das Triazol dissoziiert und der Cu(I)-Katalysator regeneriert sich.
Die CuAAC ist schnell, effizient, selektiv und einfach durchf¨uhrbar und findet heute zahlreiche Anwendungen[36] in der organischen Synthese, kombinatorischen Chemie, Polymerchemie, Materialchemie und chemischen Biologie. Jedoch verhindert die Toxi- zit¨at[37]des Cu(I)-Katalysators die Anwendungen der CuAAC in lebenden Systemen.
Um die Biokompatibilit¨at der Azid-Alkin-Cycloaddition zu verbessern, wurde aus- probiert die Alkine durch Ringspannung ohne Metallkatalysator zu aktivieren. Die Studien[38] zeigten bereits, dass das Cyclooctin ein geeigneter Kandidat zu die- sem Zweck ist. Aber die Reaktionsgeschwindigkeit der spannungskatalysierten Cy- cloaddition war in ersten Untersuchungen deutlich langsamer als die CuAAC. Durch Einf¨uhren der elektronenziehenden Fluoratome (z.B. DIFO: difluoriertes Cyclooctin) an der Propargylposition wird die Geschwindigkeit erh¨oht und eine Reihe der Ver- bindungen wird entwickelt. Das Azacyclooctin[39]und das Benzocyclooctinol[40]sind typisch f¨ur solche Verbindungen. Die entwickelte Methode wird kupferfreie Click- Reaktion (Abbildung 1.2.2.2) genannt. Die kupferfreie Click-Reaktion erm¨oglicht die Abbildung azidmarkierter Biomolek¨ule nicht nur in komplexen biologischen Umge- bungen sondern auch in lebenden Systemen[41].
Abbildung 1.2.2.2: Schematische Darstellung der kupferfreien Click-Reaktion.
1.2.3 Staudinger-Ligation
Eine andere Reaktionsm¨oglichkeit f¨ur das Azid ist die Staudinger-Ligation[42]. Die Staudinger-Ligation ist eine Modifikation der klassischen Staudinger-Reduktion[43]
von Aziden mit Triphenylphosphan.
Abbildung 1.2.3.1: Der Reaktionsmechanismus der Staudinger-Ligation von Aziden und Triarylp- hosphanen. Unter der Spaltung des Stickstoffs bildet sich ein intermedi¨ares Aza-Yild. Anschließe- nd cyclisiert das Aza-Yild zu einem intramolekularen Amid. Die Hydrolyse des Amids liefert ein stabiles Ligationsprodukt.
Wie in Abbildung 1.2.3.1[44] dargestellt wird, greift das Phosphoratom das Azid an und bildet unter der Abspaltung des Stickstoffs ein intermedi¨ares Aza-Yild. Anschlie- ßend wird das nukleophile Aza-Yild durch intramolekulare Cyclisierung unter Amid- bindung abgefangen. Im n¨achsten Schritt wird das intramolekulare Amid in w¨ass-
riger Umgebung spontan hydrolysiert und liefert ein stabiles Ligationsprodukt und das Phosphanoxid. Die Vorteile der Methode sind, dass diese Reaktion bei Raum- temperatur und in Wasser quantitativ verl¨auft und beide Ausgangsstoffe abiotisch sind. Deshalb kann die Staudinger-Ligation beispielsweise zur Markierung von Bio- molek¨ulen wie Glycane, Lipide, DNA und Proteine in ihren vielen zellul¨aren Umge- bungen benutzt werden[45].
Eine weitere Entwicklung der Methode wurde besonders f¨ur die Proteinsynthese an- gepasst. Die sogenannte spurlose Staudinger-Ligation wurde von Raineset.al.[46]und Bertozziet.al.[47]gleichzeitig beschrieben. Der Vorteil der Methode liegt daran, dass diese Modifikation eine Amidbindung liefert, ohne dass das st¨orende Triarylphosphan- oxid verkn¨upft werden kann. Der Verlauf der spurlosen Staudinger-Ligation wird in Abbildung 1.2.3.2 dargestellt.
Abbildung 1.2.3.2: Der Reaktionsmechanismus der spurlosen Staudinger-Ligation mit dem Thiol- Hilfsstoff.
Das Diphenylphosphanylmethanthiol als Thiol-Hilfsstoff wird am C-Terminus eines Peptids 1 angreifen und danach einen C-terminalen Phosphanylthioester bilden. Der Phosphanylthioester reagiert anschließend mit einem Azido-Peptid 2 unter Bildung eines Iminophosphorans. Das Iminophosphoran lagert sich intramolekular um und f¨uhrt zum Amidophosphonium-Salz. Nach der Hydrolyse in w¨assriger Umgebung
erh¨alt man ein Amid. Ein entscheidender Punkt zur nativen chemischen Ligation (NCL)[48] ist, dass die spurlose Staudinger-Ligation keinen Cysteinrest an der Ver- kn¨upfungsstelle ben¨otigt.
Obwohl die Staudinger-Ligation vielf¨altige Anwendungsm¨oglichkeiten in der zellul¨aren Biologie hat, unterliegt sie aber noch Einschr¨ankungen: Sie hat eine relativ langsa- me Reaktionskinetik und ben¨otigt hohe Konzentrationen an Triarylphosphan. Die Verbesserung der Kinetik durch Erh¨ohung der Nukleophilie der Phosphanreagentien und eine gr¨oßere Anf¨alligkeit gegen Phosphanoxidation an der Luft erm¨oglichen die weitere Entwicklung der Staudinger-Ligation, um eine ¨außerst geeignete Methode in der chemischen Biologie zu werden.
Außer der vorgestellten Click-Reaktion und der Staudinger-Ligation gibt es noch viele andere bioorthogonale Reaktionen[49]. Die bioorthogonalen Reaktionen er¨offnen neue M¨oglichkeiten f¨ur biologische Untersuchungen und grundlegende Entdeckungen auf Gebieten der Biophysik, der chemischen Biologie und der Medizin.
1.3 Modifikationen von NAD
+NAD+als Coenzym ist nicht nur an zahlreichen zellul¨aren Redoxreaktionen des Stoff- wechsels beteiligt, sondern es ist auch ein funktionelles Molek¨ul in vielen Aspek- ten des Lebens. Es wurde festgestellt, dass NAD+ eine entscheidende Rolle in der Calcium-Hom¨oostase[50], Zellproliferation[51], Alterung[52], Apoptose[53], kovalenten Protein Modifikation[54], Genexpression und Regulation zahlreicher NAD+-abh¨angi- ger Emzyme[55] spielt. Die aktuellen Studien zeigen, dass NAD+ als Immunregula- tor[56] fungiert oder den Tod von T-Zellen[56] induzieren kann. Um seine Funkti- on in komplexen biologischen Prozessen zu erforschen, ist man auf unterschiedliche Modifikationen des Molek¨uls angewiesen. Allgemein kann das NAD+-Molek¨ul in der
Adenosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modi- fiziert werden (Abbildung 1.3.1).
Abbildung 1.3.1: Modifikationsm¨oglichkeiten des NAD+-Molek¨uls. Das Molek¨ul kann in der Ad- enosin-, der Diphosphat (PPi)- und der Nicotinamid-Ribosid-Untereinheit modifiziert werden.
Um den molekularen Mechanismus der NAD+-beteiligten biochemischen Prozesse zu entschl¨usseln, wurden verschiedene modifizierte NAD+ in den aktuellen Untersu- chungen verwendet. Hirst et. al.[57] verwendete ein Wasserstoffisotop f¨ur die Detek- tion der ¨Ubertragung des Hydrid-Ions w¨ahrend der NADH Oxidation ¨uber NADH- Dehydrogenase. Obwohl die NADH-Dehydrogenase vor mehr als 50 Jahren erstmals gereinigt wurde[58], ist zum Mechanismus der Redox-getriebenen Protonentranslo- kation nur wenig bekannt[59]. Man weißt nicht, wie die Proton¨ubertragung zwischen der C4-Position des Nicotinamidrings und der N5-Position vom Flavinmononukleotid (FMN) erfolgt. Hirstet.al. bereitete dasR-NADD undS-NADD als NAD+-Analoga vor und f¨uhrte die Kinetikmessung des Oxidationsschritts durch. Aus gemessenen Experimentdaten wurde herausgefunden, dass die Reaktionsgeschwindigkeit von S- NADD im Vergleich vom NADH signifikant gesunken ist und deutlich ein prim¨arer kinetischer Isotopeneffekt hinwies. Es best¨atigte sich, dass die Hydrid¨ubertragung stereospezifisch von der pro-S Position des Nicotiamidrings aus stattfindet. Und zu- sammen mit der NAD+-Dissoziation sind beide zum Teil der geschwindigkeitsbe- stimmende Schritt f¨ur NADH Oxidation ¨uber NADH-Dehydrogenase[57]. Im ande- ren Fall berichtete Li et. al.[60] die Synthese und Evaluation der Azido- und Diazo- NAD+-Analoga in Photoaffinit¨atsmarkierungsexperimenten. Die Azidogruppe an der 2- bzw. 6-Position des Adenins kann leicht zu einem Tetrazol isomerisieren[61]. Des-
halb wurden einige Modifikationen am Pyridinring von NAD+ angebracht. Eine von der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus der Leber katalysierten Redoxreaktion wurde als ein Modell f¨ur die Untersuchung der NAD+-Analoga eingesetzt. Die Erbenisse[60]
zeigten, dass die NAD+-Analoga die Coenzymaktivit¨at besaßen, wenn das Molekul die Carbonylgruppe enth¨alt. Es wurde darauf hingewiesen, dass die Carbonylgrup- pe in der Redoxreaktion eine wichtige Rolle f¨ur Bildung einer Wasserstoffbindung mit dem Enzym spielte. Die Subsitution vom α-Diazoketon bzw. Arylazido-Rest an der Carboxamidgruppe des Nicotinamids und die Azidogruppe an der 5-Position des Pyridinrings zeigten zwar keine Coenzymaktivit¨at, aber die Molek¨ule senkten die Re- aktionsgeschwindigkeit der Bildung von NADH, wenn das nat¨urliche NAD+ in der enzymatischen Reaktion vorhanden war. Solche Modifikationen k¨onnen als Inhibitor
¨ahnlich der Redoxreaktion angewendet werden.
Die NAD+-Analoga wurden nicht nur in der Untersuchung der Redoxreaktion ge- braucht, sondern sie hatten auch Anwendungsm¨oglichkeiten in der Forschung der ADP-Ribosylierung. Die Arbeitsgruppe von Lin hat berichtet, dass eine Propargyl- gruppe auf die 6-Position bzw. 8-Position des Adenosins[62] gebracht wurde und die erhaltenen NAD+-Analoga[62] in vitro getestet wurden. Mit Hilfe einer Click- Reaktion k¨onnen die auf Proteine ¨ubergetragenen ADPR-Einheiten und die entspre- chenden Proteine durch fluoreszierende Farbstoffe in SDS-Gel visuell dargestellt wer- den. Zuerst wurde diese Methode zur Untersuchung der ART-Aktivit¨at von Sirtui- nen[63]verwendet. Es wurde herausgefunden, dass das 6-Alkin-NAD+ein Substrat f¨ur die Deacetylierungsreaktionen ist und das 8-Alkin-NAD+ inaktiv war. Jedoch kann beim 6-Alkin-NAD+keine Aktivit¨at der Sirtuin-abh¨angige ADP-ribosylierung festge- stellt werden. Ein eventueller Grund liegt darin, dass die ADP-Ribosylierungsaktivit¨at von Sirtuinen nicht physiologisch relevant sein k¨onnte. Außerdem wurden vier m¨ogli- che Mechanismen f¨ur Sirtuin-abh¨angige ADP-Ribosylierung aus den relativen Experi- mentdaten dargestellt. Linet.al.[64]fokussierte noch seine Untersuchungen mit Hilfe von 6- bzw. 8-Alkin-NAD+durch die Markierung und zur Identifizeirung der entspre-
chenden Substratproteine in der Poly(ADP-Ribos)ylierung. Durch die gleiche Metho- de kann er sowohl das ARTD1 selbst als auch andere Proteine wie p53, RAP74(TFIIF- Untereinheit), TRF1, sowie mehrere mitochondrialen Proteine markieren. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann noch abgeleitet werden, dass das 8-Alkin-NAD+ auch kein effizientes Substrat f¨ur ARTD1 ist. Wahrscheinlich erzeugt die Alkinmodifika- tion auf der 8-Position des Adenosins die sterische Hinderung, wenn es an ARTD1 bindet[64]. Außerdem k¨onnen ¨uber 70 ADPR-markierte Substratproteine[64]aus dem ARTD1 niedergeschlagenen Zelllysat durch Biotin-Affinit¨atstag herausgefischt und separat identifiziert werden.
Außerdem wurden einige NAD+-Modifikationen als Inhibitor der NAD+-abh¨angigen Enzyme in verschiedenen Metabolismen verwendet. Durch Hemmung einer Aktivit¨at der beteiligten Enzyme konnte man schließen, welche Funktion NAD+ in diesem Fall besitzt. Ein Beispiel der NAD+-Modifikationen ist die spezifische Hemmung der NAD+-Glycohydrolaseaktivit¨at von CD38, das nach der HIV-Infektion h¨aufig als Marker bei der B- und T-Zellaktivierung verwendet wird (HIV-Monitoring)[65]. Wall et. al.[66] wollte wirksame und spezifische Inhibitoren verf¨ugen und versuchte dadurch zu ermitteln, wie die cADPR-Aktivit¨at mit der biologischen Funktion von CD38 in Zusammenhang steht. Das synthetisierte Carba-NAD+ und Pseudocarba- NAD+ wurden in das Enzymassay eingesetzt und es wurde aus gemessenen IC50- Werte[66] festgestellt, dass das Pseudocarba-NAD+ eine signifikante Aktivit¨at zur Hemmung der einigen Enzyme, insbesondere zum menschlichen CD38 zeigte. Die Ergebnisse[66] wiesen darauf hin, dass die ungew¨ohnliche Stereochemie dieses Di- nukleotids eine hochspezifische Pyridin-Dinukleotid-Bindungsstelle in den sensitiven Enzymen beinhaltet und der Mechanismus der Hemmung die Bildung eines tern¨aren Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplexes ben¨otigt. Ein anderes Beispiel ist Synthese und Evaluation der C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylnicotinamid. Es wurde beschrie- ben, dass solche Analoga mit verschiedenen biologischen Wirkungen von Anti-Tumor- Aktivit¨aten ausstatten[67] und einige derzeit in klinischen Studien getestet sind[68].
Migaud et. al.[69] synthetisierte drei neuartige C-Nukleosid-Analoga vom Ribosylni- cotinamid, um bestimmte Strukturmerkmale zur spezifischen Erkennung aufzuzeigen und die Enzym- und Zellselektivit¨at zu optimieren. Im Screening wiesen zwei β- NAD+-Analoga die selektive Hemmung der Dehydrogenaseaktivit¨at auf. Diese Wirk- samkeit ist von der Substitutionsstruktur eines Thiophenrings abh¨angig. Die effekti- ve Hemmung wird erzielt, wenn die Substitutionsgruppe als ein Wasserstoffbr¨ucken- Akzeptor wirkt und sie die elektrostatische Wechselwirkung des Sauerstoff-Atoms in der Furanose kompensieren kann.
Aus einigen beschriebenen Bespielen wurde herausgefunden, dass NAD+ ein vielf¨alti- ges Molek¨ul ist. Die durch Einf¨ugung der verschiedenen Funktionalit¨aten modifizier- ten NAD+-Molek¨ule sind ein erforderliches und sehr hilfreiches Werkzeug, das in den enzymtiachen Untersuchungen verwendet wird um eigene Funktionen des Mole¨uls live in lebenden Zellen w¨ahrend der DNA-Reparatur oder in anderen biologischen Pro- zessen zu beobachten und den Mechanismus der NAD+-beteiligten Reaktionen sowie neue biologische Signalwege, die durch bekannte oder neue NAD+-konsumierende Reaktionen reguliert sind, zu verstehen. Die herausgefundenen Resultate erm¨ogli- chen ein breites Spektrum von Anwendungen in der weiteren Grundlagenforschung der chemischen Biologie und Medizin, der Medikamentenherstellung und der Krank- heitsbek¨ampfung.
1.4 ARTD1 und Poly(ADP-Ribos)ylierung
Poly(ADP-Ribos)ylierung ist eine kovalente PTM von Proteinen, die durch ARTs ka- talysiert (Abbildung 1.4.1) wird. Vor 50 Jahren publizierten Chambon[70]und andere Forscher erstmals eine neue Entdeckung, bei der ein nukleins¨aureartiges Polymer aus NAD+entstand. Die genaue chemische Identit¨at des gebildeten Polymers, die zugrun- de liegende enzymatische Reaktion und ihre Hochregulation durch DNA-Sch¨adigung
wurden innerhalb weniger Jahre beschrieben und nun als Poly(ADP-Ribos)ylierung, eine neue Art der PTM, benannt, die haupts¨achlich im Zellkern stattfindet und an vielen wichtigen zellul¨aren Mechanismen[71] beteiligt ist.
Abbildung 1.4.1: Poly(ADP-Ribos)ylierung und Struktur der Poly(ADP-Ribose). Die einzelnen ADPR-Einheiten sind ¨uberα-O-glykosidische Bindungen verkn¨upft. Die Linearit¨at des Polymers erfolgt ¨uber 100-20-Verkn¨upfungen und die Verzweigungen sind 1000-200 verlinkt.
1.4.1 ARTD1
ARTD1 (ADP-Ribosyltransferase Diphtherietoxin-¨ahnlich 1, fr¨uher bekannt als PA- RP-1) ist das am besten untersuchte Mitglied der ARTD-Familie[72]. ARTD1 ist ein 113 kDa großes, 1014 Aminos¨auren langes, nukle¨ares Protein, das in allen euka- ryotischen Zellen vorkommt[72], und das haupts¨achlich in der DNA-Reparatur und an der Apoptose beteiligt ist. Diese ARTD-Familie besteht aus 18 Mitgliedern[5], die sehr unterschiedliche Strukturen und Funktionen[72]besitzen. Bisher wurden nur
bei wenigen Mitgliedern ARTD1 (PARP-1), ARTD2 (PARP-2), ARTD3 (PARP-3), ARTD4 (vPARP oder PARP-4), ARTD5 (Tankyrase-1 oder PARP-5a) und ARTD6 (Tankyrase-2 oder PARP-5b) nachgewiesen, dass sie Poly(ADP-Ribose)transferase- Aktivit¨at[73] zeigen.
Abbildung 1.4.1.1: Schematische Darstellung der ARTD1 funktionellen Dom¨anen[74].
ARTD1 wurde 1963 erstmals entdeckt[70] und 1966 aus Rattenleber isoliert[75]. Es besteht strukturell aus drei Dom¨anen: einer DNA-bindenden Dom¨ane (DBD) am N-Terminus, einer Automodifikationsdom¨ane und einer katalytischen Dom¨ane am C-Terminus (Abbildung 1.4.1.1[74]). Die 46 kDa große DBD enth¨alt drei Zinkfinger- Dom¨anen und eine Kernlokalisierungsequenz (NLS: Nuclear Localisation Signal) mit einer Schnittstelle f¨ur die apoptotischen Enzyme Caspase 3 und Caspase 7 (DEVD- Sequenz: Asp-Glu-Val-Asp). Die Zinkfinger-Dom¨ane-1 und Dom¨ane-2 sind verbrei- tete DNA-Bindungsmotive, die strukturell jeweils 28 bzw. 30 Aminos¨auren enthal- ten und in denen Zn2+-Ionen von drei Cystein- und einem Histidin-Rest (Cys21, Cys24, His53, Cys56 sowie Cys125, Cys129, His159, Cys162)[76]komplexiert werden.
Sie vermitteln die spezifische Bindung des Enzyms an DNA-Strangbr¨uche[76]. F¨ur ARTD1 wurde die Aktivierung sowohl durch DNA-Einzelstrangbr¨uche[77]als auch DNA-Doppelstrangbr¨uche[78] gezeigt. Jedoch ist die Bindungsf¨ahigkeit der beiden Zinkfinger-Dom¨anen mit DNA-Strangbr¨uchen unterschiedlich. Das Zinkfingermotiv- 1 interagiert haupts¨achlich bei Doppelstrangbr¨uchen, w¨ahrend das Zinkfingermoti-2
hingegen nur mit DNA-Einzelstrangbr¨uchen[79]bindet. Neben den beiden Zinkfinger- Dom¨anen ist die genaue Funktion vom Zinkfingermotiv-3 (Cys295, Cys298, Cys311, Cys321) noch unklar. Die zentrale 22 kDa große Automodifikationsdom¨ane ist die Dom¨ane, an der sich ARTD1 vor allem an Glutamatresten (15 Glutamatreste wer- den in dieser Dom¨ane konserviert) selbst poly(ADP-Ribosyl)iert. Zus¨atzlich enth¨alt diese Dom¨ane ein BRCT (Breast Cancer Carboxaterminal)-Bindungsmotiv, das f¨ur Protein-Protein-Wechselwirkungen z.B. mit XRCC1[80] verantwortlich ist. In der ka- talytischen Dom¨ane (54 kDa) befindet sich die NAD+-bindende Dom¨ane. Dort fin- det die eigentliche Poly(ADP-Ribos)ylierung statt. Katalytische Aktivit¨aten dieser Dom¨ane bringen die Synthese des ADPR-Polymers und dessen Bindung an Zielpro- teine in Zusammenhang und bestehen aus NAD+-Hydrolyse, Initiation, Elongation, Verzweigung und Beendigung des Polymers. Die katalytische Dom¨ane von ARTD1 ist sehr groß und kann allgemein in zwei Teile unterteilt werden: die Akzeptor- Stelle[81] und die Donor-Stelle[81]. Die Akzeptor-Stelle ist mit der ADP-Einheit der PAR-Ketten besch¨aftigt, wobei die Donor-Stelle mit NAD+ belegt ist. Die Donor- Stelle besteht noch aus drei Untereinheiten: die Nicotinamid-Ribose-Bindungsstelle (NI-Stelle)[81], die Phosphat-Bindungsstelle (PH-Stelle)[81] und die Adenin-Ribose- Bindungsstelle (AD-Stelle)[81]. Die Region von 859 bis 908 wird allgemein als die
”PARP-Signatur“ bezeichnet, jedoch wurde sie nicht umfassend charakterisiert und ihre genaue Funktion ist noch unbekannt.
1.4.2 Poly(ADP-Ribose)
Poly(ADP-Ribose) (PAR) ist ein nukleins¨aureartiges Polymer, das als Signalmolek¨ul bei zellul¨arem Stress[82] und an vielen anderen Prozessen beteiligt ist. PAR besitzt eine sehr komplexe Struktur (Abbildung 1.4.1). Im Unterschied zu DNA oder RNA erfolgt eine lineare Verkn¨upfung der Monomere jedoch ¨uber 100-20-α-O-glykosidische Ribose-Ribose-Bindungen[83]. Weiterhin kann PAR noch Verzweigungen durch ei- ne Verkn¨upfung der ADPR Einheiten ¨uber 1000-200-α-O-glykosidische Bindungen[84]
bilden. Diese glykosidischen Bindungen f¨uhren zur Verl¨angerung und Verzweigung der Ketten um bis zu 200-ADPR Einheiten. Die Verzweigungen treten jedoch im Durchschnitt nach 20 ADPR-Einheiten auf und haben somit relativ regelm¨aßige Abst¨ande[72]. Nach Aktivierung der PAR-Synthese wird sich die Konzentration der Polymere im Zellkern um das 100-500 fache erh¨ohen[71]. Jedoch besitzt PAR in der Zelle nur eine geringe Halbwertszeit in weniger als einer Minute[85], da gleichzei- tig zur Synthese bereits der enzymatische Abbau des Polymers erfolgt. Der Abbau von PAR erfolgt spezifisch durch die Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG), die PAR zwischen den beiden Ribose-Einheiten schneidet[86]. Als Abbauprodukt entsteht freie ADPR. Die ADP-Ribose-Pyrophosphatase hydrolysiert frei stehende ADPR in AMP und Ribose-5-Phosphat[87], die in der NAD+-Biosynthese und anderen Prozes- sen recycelt werden k¨onnen.
1.4.3 Poly(ADP-Ribos)ylierung und ihr Mechanismus
Zur ausf¨uhrlichen Ermittlung des molekularen Mechanismus der Poly(ADP-Ribos)yl- ierung wurden zahlreiche Studien durchgef¨uhrt. Dabei wurde herausgefunden, dass es sich bei PAR um ein sehr komplexes Biopolymer mit linearen und verzweigten Ketten handelt. Bei der Initiierung der Poly(ADP-Ribos)ylierung brechen ARTD1 und ARTD2 die N-glykosidische Bindung des Nicotinamids im NAD+-Molek¨ul auf und ¨ubertragen die erste ADP-Ribosyl-Gruppe auf einen Aminos¨aurerest von Glut- amat (Glu)[88], Aspartat (Asp)[88] mit der Carboxylat-Seitenkette oder von Lysin (Lys)[89]mit der Amino-Seitenkette von Zielproteinen. Zu den Proteinen geh¨oren z.B.
ARTD1 selbst[90], Histone[91], der Tumorsuppressor p53[92], DNA-Ligasen[93], DNA- Polymerasen[94], DNA-Topoisomerasen[95] und DNA-abh¨angige Proteinkinasen[96]
sowie viele andere Proteine. Anschließend werden weitere ADPR Einheiten an 2- OH Gruppen der beiden Riboseringe angebaut und diese distale Addition der ADPR Einheiten ¨uber 100-20-α-O-glykosidische Bindungen bzw. 1000-200-α-O-glykosidische Bin- dungen f¨uhrt zur schrittweisen Verl¨angerung und Verzweigung der PAR-Ketten[97].
Basiert auf Kristallstrukturdaten[98] zwischen dem katalytischen Fragment des En- zyms (PARP-CF, Aminos¨aure: 662-1014) und dem carba-NAD+ wurde ein Modell f¨ur die Synthese von PAR dargestellt (Abbildung 1.4.3.1 und 1.4.3.2).
Abbildung 1.4.3.1: Schematische Darstellung des Mechanismus der Elongation der Poly(ADP-Ri- bos)ylierung. NA: Nicotinamid. Der Aminos¨aurerest initiiert einen nukleophilen Angriff auf das C1-Atom des Donors und verkn¨upft es zum ersten ADPR. W¨ahrend der Elongation unterst¨utzt der Aminos¨aurerest Glu988 den n¨achsten Angriff des Donors und die 100-20-α-O-glykosidische Ve- rkn¨upfung der ADPR.
In der katalytischen Dom¨ane wird das Donor-NAD+(Abbildung 1.4.3.1) in einer Form gebunden, sodass die N-glykosidische Bindung destabilisiert wird und die Spaltung dieser Bindung ¨uber einen SN2-dissoziativen Mechanismus durch eine ¨Ubergangs- struktur eines ADP-Ribosyloxocarbeium-Ions[99] verl¨auft. In diesem ¨Ubergangszust- and[100] interagieren die 20-OH Gruppe des Doners und des Akzeptors mit einer des Carboxylsauerstoffatoms vom Aminos¨aurerest Glu988 und 30-OH Gruppe des Ak- zeptors in Wechselwirkung mit dem anderen Carboxylsauerstoff von Glu988. Gleich- zeitig bildet diese OH-Gruppe noch eine Wasserstoffbr¨ucke mit dem Aminos¨aurerest
Tyr907. Damit wird die Nukleophilie der 20-OH Gruppe des Akzeptormolek¨uls erh¨oht und erm¨oglicht den nukleophilen Angriff auf das C1-Atom des Donors. Um die Ver- zweigungsstelle (Abbildung 1.4.3.2) zu erzeugen, muss das Akzeptormolek¨ul um 180◦ rotieren[100]. Dadurch r¨uckt der neue Donor in die Akzeptorposition und die beiden Molek¨ule werden anschließend miteinander verkn¨upft.
Abbildung 1.4.3.2: Schematische Darstellung des Mechanismus der Verzweigung der Poly(ADP-R- ibos)ylierung. NA: Nicotinamid. In der Verzweigungsreaktion wird das Akzeptormolek¨ul um 180◦ gedreht und damit erm¨oglichen das Donor- und Akzeptormolek¨ul eine 1000-200-α-O-glykosidische Verkn¨upfung.
1.4.4 Identifikation der spezifischen ADPR-Akzeptorstellen
Wie bereits schon im vorherigen Abschnitt geschrieben wurde, spielt NAD+ in der ARTD1 katalysierten Poly(ADP-Ribos)ylierung eine bedeutende Rolle. Die Komple- xit¨at von erzeugter PAR stellt jedoch in der Erforschung eine Herausforderung dar:
1. Die Halbwertszeit von PAR betr¨agt in vivo nur wenige Minuten und sie wird danach durch PARG abgebaut.
2. Die Vielzahl der m¨oglichen Modifikationsstellen innerhalb eines Substratprote- ins erschwert die Identifizierung der Positionen der Modifikationen.
3. Unterschiedliche L¨angen des einzelnen Polymers und mehrere Verzweigungs- punkte innerhalb jeder Kette steigern die Komplexit¨at des Systems signifikant.
Bestrebungen, direkte Zielproteine der ARTs sowie deren spezifische ADPR-Akzep- torstellen zu identifizieren, m¨ussen diese Komplexit¨at von PAR ¨uberwinden, welche die nachfolgenden Analysen erschweren. Die zurzeit entwickelten Herangehensweisen machen sich zunutze, dass mutierte ARTs lediglich Mono(ADP-Ribos)ylierung ka- talysieren. Sie benutzen proteinbasierte oder chemische Strategien zur Anreicherung oder spalten PAR-Ketten vom Substrat ab, was zu einer Markierung f¨uhrt, oder sie benutzen chemisch ver¨anderte NAD+-Analoga:
1. Wie bereits im Abschnitt 1.4.3 ge¨außert, spielt der Aminos¨aurerest Glu988 eine wichtige Rolle in der Poly(ADP-Ribos)ylierung. Liu et. al.[90] mutierte diesen Glutamins¨aure-Rest zu Glutamin. Dadurch kann der ARTD1-E988Q-Mutant nur ADPR-Monomer in der Reaktion bilden und die mono(ADP-Ribos)ylierte Automodifikationsdom¨ane wurde anschließend durch Massenspektrometrie ana- lysiert und die Modifikationsstellen innerhalb der Dom¨ane identifiziert.
2. Goodlett et. al.[101] verwendete die Phosphodiesterase nach Automodifikati- on von ARTD1, um die Phosphodiesterbindung in PAR zu spalten. Anschlie- ßend wurde ARTD1 durch Trypsin verdaut. Ein entstandenes Peptid betrug
ein Ribose-50-Phosphat, wenn die Aminos¨aure innerhalb des Peptids bereits poly(ADP-Ribos)yliert wurde. Durch Vergleich der Peptidmasse vor und nach Poly(ADP-Ribos)ylierung in der Massenspektrometrie ist eine Identifizierung der Modifikationsstellen von ARTD1 m¨oglich. Durch dieses Verfahren wurden mehrere Modifikationsstellen von ARTD1 gefunden.
3. Eine andere Methode[102] war, dass die entstandene Esterbindung zwischen Aminos¨auren und PAR nach Automodifikation durch einen nukleophilen An- griff vom Hydroxylamin gespalten und ARTD1 anschließend verdaut wurde. Der Unterschied von 15 Da vor und nach Poly(ADP-Ribos)ylierung in der Massen- spektrometrie zeigt auch eine M¨oglichkeit zur Identifizierung der Modifikations- stellen auf.
4. Die Arbeitsgruppe von Lin synthetisierte zwei NAD+-Analoga[62], die eine Pro- pargylgruppe auf die 6-Position bzw. 8-Position des Adenosins enthalten. Nach der Click-Reaktion k¨onnen die in vitro auf Proteine ¨ubergetragenen ADPR- Einheiten und die entsprechenden Proteine durch fluoreszierende Farbstoffe in SDS-Gel visuell dargestellt werden. Außerdem k¨onnen die ADPR-markierten Substratproteine[64]durch Biotin-Affinit¨atstag herausgefischt und separat iden- tifiziert werden.
Obwohl jede Methode im eigenen Fall funktionierte, gibt es jedoch noch zu beach- tende Punkte: In der Methode von Liu wurde nur das mutierte Enzym untersucht.
Man weiß nicht, ob die durch Mutation erhaltenen Ergebnisse in der Automodifi- kationsdom¨ane des mutierten Enzyms auch direkt ins nat¨urliche Enzym ¨ubertragen werden k¨onnten. Zwar war die Untersuchungsstrategie von Goodlett f¨ur das nat¨urli- che Enzym verwendbar, aber die Durchf¨uhrung des Experiments ist sehr arbeits- aufwendig. Außerdem entstanden nach der Verdauung vom Trypsin nicht nur ein Ribose-50-Phosphat, sondern je nach der Schnittstelle noch viele anderen Fragmen- te, wie zum Beispiel 50-Adenosinmonophosphat (50-AMP), Phosphoribosyladenosin- monophosphat (PRAMP) oder Diphosphoribosyladenosinmonophosphat (PR2AMP).
Diese verdauten Fragmentmischungen aus Peptiden und Phosphaten erschweren die Ergebnisanalyse in der Massenspektrometrie. Die dritte Methode war auch allgemein tauglich, jedoch k¨onnen nur die Modifikationsstellen mit Esterbindung identifiziert werden. Wo das Lysin mit ADPR eine Form von Schiffscher Base[103] bildet, ist die Untersuchung der Modifikationsstellen von Lysin in diesem Fall unm¨oglich. Damit ist das Untersuchungsergebnis nicht vollst¨andig. Die Entwicklung von Lin0s Arbeits- gruppe war zwar sehr erfolgreich f¨ur die visuelle Darstellung und Herausfischung der Substratproteine, jedoch waren die NAD+-Analoga wegen der Komplexit¨at der ent- standenen PAR nicht in der Lage, die spezifischen ADPR-Akzeptorstellen innerhalb ARTD1 oder eines anderen Substratproteins zu identifizieren.
F¨ur weitere Erforschung dieses Gebiets werden noch mehr geeignete Methoden mit vielf¨altigen Nutzungsm¨oglichkeiten oder einfache und taugliche Werkzeuge nachge- fragt werden.
1.5 ARTD1 und DNA-Reparatur
1.5.1 Uberblick ¨ ¨ uber ARTD1 und DNA-Reparatur
Die DNA ist die Tr¨agersubstanz der genetischen Information. Ein Schaden in der DNA kann jedoch den gesamten Organismus in Gefahr bringen, wenn dadurch der genetische Code f¨ur die Synthese eines funktionell bedeutenden Proteins ver¨andert wird. Dies kann zum Tod des Organismus f¨uhren oder zu einem zunehmenden Ver- lust von zellul¨aren Funktionen sowie zu einem unkontrollierten Zellwachstum, wie es zum Beispiel bei Krebszellen der Fall ist[8]. Es treten verschiedene Arten von DNA-Sch¨aden auf (Abbildung 1.5.1.1[104]), z.B.: die Hydrolyse einer Nukleobase oder der Austausch gegen andere, fehlende oder zus¨atzliche Nukleotide, die Quer- vernetzung von DNA-Str¨angen oder Br¨uche im Zucker-Phosphat-R¨uckgrat[104]. Es entstehen etwa 104 - 105 DNA-Sch¨aden pro Zelle pro Tag[104]. F¨ur die Reparatur
von DNA-Sch¨aden, wie die Desaminierung, Oxidation oder Alkylierung der Nukleo- basen sowie DNA-Einzelstrangbr¨uche (SSB) ist haupts¨achlich die Basenexzisionsre- paratur (BER)[105] zust¨andig. Großr¨aumige DNA-Sch¨aden, wie die Pyrimidindimere werden vor allem durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER)[106] beseitigt. Dop- pelstrangbr¨uche werden durch das nicht-homologes End-Joining (NHEJ)[107]oder die homologe Rekombination (HR)[108] repariert. Die Mismatch-Reparatur (MMR)[109]
korrigiert die in der DNA-Replikation entstandenen Basenfehlpaarungen.
Abbildung 1.5.1.1: DNA-Sch¨aden durch chemische Substanzen, spontane Mutationen, reaktive Sauerstoffspezies, UV-Strahlung oder fehlerhafte Replikation und deren entsprechenden Repara- turmechanismen[104].
ARTD1 ist gut bekannt durch die Beteiligung an DNA-Reparaturen. Die DBD der ARTD1 bindet DNA-Br¨uche, die direkt oder indirekt durch Oxidation, Alkylierung, Basenexzision und viele andere Arten von DNA-Sch¨aden erzeugt werden. Im Ver- gleich zum Ruhezustand von ARTD1, steigert diese Protein-DNA-Interaktion die Aktivit¨at der katalytischen Dom¨ane auf das mehrere Hundertfache. Infolgedessen werden ADPR-Einheiten auf verschiedene Zielproteine ¨ubertragen. Diese PTM re- krutieren andere Proteine und dadurch erm¨oglichen die beteiligten Enzyme Zugriff auf und Reparatur der besch¨adigten DNA-Stellen. Die DNA-Reparaturmechanismen und ihre zust¨andigen ARTD1 Funktionen[110] wurden in der folgenden Tabelle (Ta- belle 1.5.1.1[110]) zusammengefasst.
Tabelle 1.5.1.1: Beteiligung von ARTD1 in DNA-Reparaturmechanismen[110].
DNA-Reparaturmechanismus ARTD1 Funktion
Basenexzisionsreparatur (BER)
Bindung an der AP-Stelle, Rekrutierung des Reparaturproteinkomplexes durch ARTD1 Automodifikation
Einzelstrangbruch-Reparatur (SSBR)
Rekrutierung des Reparaturprotein- komplexes durch ARTD1 Automodifi- kation
Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ADP-Ribosylierung von XPA Mismatch-Reparatur (MMR) ADP-Ribosylierung von MSH6
Nicht-homologes End-Joining (NHEJ)
Erh¨ohung der ARTD1 Aktivit¨at durch Ku, ADP-Ribosylierung und Aktivie- rung von DNA-PKCS
Homologe Rekombination (HR)
Rekrutierung von Mre11 durch ARTD1 Automodifikation
Aktivierung der ATM-Signal¨ubertra- gung durch PAR
1.5.2 Einfluss von ARTD1 in Basenexzisionsreparatur und Einzelstrangbr¨ uchen
Bei der BER wird ein Fehler in der Basenpaarung in einer der beiden DNA-Str¨ange behoben. Es gibt zwei Arten von Fehlern: DNA-Einzelstrangbr¨uche oder Modifika- tionen der Nuklobasen. Ein bedeutender Unterschied zwischen beiden besteht darin, dass in einem Fall freie DNA-Einzelstrangbr¨uche in der Zelle vorliegen, die von dem Reparaturproteinenkomplex (ARTD1, XRCC1) detektiert werden m¨ussen. Beim an- deren dagegen werden Einzelstrangbr¨uche als enzymatische Intermediate w¨ahrend der
