4.2.1 Mikroorganismen, Phagemid und Helferphage
Für die Arbeiten mit Bakteriophagen wurden zwei E. coli Stämme ausgewählt, die beide das Fertilitätsplasmid (F-Plasmid) tragen, wodurch die Bildung eines F-Pilus ermöglicht wird. F-Plasmid tragende Stämme fungieren beim horizontalen Gentransfer der Konjugation als Spender. Der F-Pilus ist essentiell für die Infektion der Wirtszellen, da die Bakteriophagen zunächst an den Pilus adsorbieren, bevor die Einzelstrang DNA (ssDNA) in das Cytoplasma injiziert wird. Die Stämme und der Genotyp sind in Tabelle 4.5 beschrieben.
Beide Stämme können für Klonierungsexperimente eingesetzt werden, da sie durch verschiedene Mutationen den Verdau von fremder DNA oder eine ungewünschte Rekombination verhindern. Dabei sind vor allem die Mutation der nicht spezifischen Endonuclease I (endA1) und einer Rekombinase (recA1) nennenswert. Aus diesen Gründen sind sie ebenfalls für die Arbeiten mit Bakteriophagen M13 geeignet. Beide haben eine Deletion in der Thiaminsynthese (thi-1), daher wurde für die Kultivierung in definiertem Medium Thiamin zugesetzt.
Tabelle 4.5 Verwendete Mikroorganismen
Stamm Genotyp
E. coli XL1-blue MRF` Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F ́ proAB lacIqZΔM15 Tn5 (Kanr) E. coli JM 109 recA1 endA1 gyr96A thi-1 hsdR17 supE44 relA1 λ
Δ(lac-proAB) (F' traD36 proAB laqIqZ ΔM15)
Der E. coli Stamm XL1-blue codiert Gene für eine Kanamycinresistenz auf dem F-Plasmid. Aus diesem Grund wurde bei der Kultivierung von E. coli XL1-blue der Selektionsdruck mittels Kanamycin benötigt, um den Verlust des F-Plasmids zu verhindern.
Der E. coli Stamm JM 109 weist eine chromosomale Deletion (Δ(lac-proAB)) auf, wodurch der Stamm auxotroph bezüglich Prolin ist. Diese Auxotrophie wird durch das F-Plasmid kompensiert. Zur Aufrechthaltung eines Selektionsdrucks, der den Verlust des F-Plasmids verhindert, ist die Kultivierung in definierten Mineralmedien notwendig.
Für die Stammhaltung wurde zunächst ein Einzelkolonieausstrich auf den jeweiligen Agarplatten (JM 109, M9-Agar; XL1-blue, LB-Agar Kan+) durchgeführt. Eine Kolonie wurde gepickt, anschließend in 5 mL des jeweiligen Mediums in sterilen Vorkulturröhrchen überführt und für 12-16 Stunden bei 37 °C und 150 rpm inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurde 1 mL in 20 mL LB-Medium (Tabelle 4.1) in einem 250 mL Schüttelkolben überführt und bis zu einer optischen Dichte von 0,6-0,8 bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Schüttelinkubator ohne Selektionsdruck kultiviert (37 °C, 250 rpm). Die Zellsuspension wurde anschließend im Verhältnis 4:1 mit 60 % (w/v) Glycerin (Endkonzentration 15 %) gemischt und in 1 mL Reaktionsgefäßen in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C.
Zur Produktion von artifizieller ssDNA wurde vom Projektpartner des Lehrstuhls für Biomolekulare Nanotechnologie der Technischen Universität München das Phagemid pBSG74 zur Verfügung gestellt, das auf dem kommerziell erhältlichen Vektor pBlueScript II (SK+) (Stratagene, San Diego, USA) basiert. Die intergene Region ist dem filamentösen Bakteriophagen f1 entnommen und M13K07 stellt einen geeigneten Helferphagen für die extrazelluläre ssDNA Produktion des Phagemids dar (Short et al.
1988). Das Phagemid pBSG74 (6813 bp) trägt lediglich ein Resistenzgen gegen Carbenicillin, den intergenen Bereich und artifizielle DNA. Diese artifizielle DNA enthält weiterhin zinkabhängige, selbstschneidende DNAzyme, die die Hydrolyse der produzierten
ssDNA ermöglicht. Der Helferphage M13K07 wurde kommerziell als Phagenstammlösung erworben (New England Biolabs®, Ipswich, USA) und identisch zum M13mp18 Bakteriophagen vermehrt.
4.2.2 Molekularbiologische Arbeiten
Herstellung chemisch-kompetenter E. coli Zellen
Die für die Transformation benötigten chemisch-kompetenten E. coli Zellen wurden für beide Stämme folgendermaßen hergestellt. Es wurde eine 5 mL Vorkultur mit einer einzelnen Kolonie im entsprechenden Medium (JM 109, M9 Medium; XL1-blue, LB-Medium) mit Selektionsdruck angeimpft und für 12-16 Stunden bei 37 °C und 150 rpm inkubiert. 50 mL LB-Medium ohne Zugabe von Antibiotikum wurden mit 2 % (v/v) der Übernachtkultur inokuliert und bei 37 °C und 250 rpm bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 0,3-0,6 in einem Schüttelkolben ohne Schikanen (500 mL) kultiviert. Die folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei 3.260 rcf und 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Anschließend wurden die Zellen in 10 mL CaCl2 (0,1 M, 4 °C, steril) resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (10 min, 3.260 rcf, 4 °C) wurde der Überstand entfernt und die Zellen in 5 mL 0,1 M CaCl2 mit 20 % (w/v) Glycerin (4 °C, steril) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden aliquotiert (90 µL) und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C.
Transformation
Die genomische ssDNA der Bakteriophagen M13mp18 und der Längenvarianten mit 7560 und 8064 Basen (Douglas et al. 2009) wurde von den Kooperationspartnern des Lehrstuhls für Biomolekulare Nanotechnologie der Technischen Universität München in einer Konzentration von 100 nM zur Verfügung gestellt. Die Lagerung der ssDNA erfolgte bei -20 °C. Zur Herstellung von Bakteriophagen wurden chemisch-kompetente E. coli XL1-blue Zellen mit der ssDNA transformiert, wodurch der Phagenzyklus intrazellulär beginnt und neue Bakteriophagen gebildet werden. Dafür wurden chemisch-kompetente Zellen auf Eis aufgetaut und 1 µL der ssDNA (100 nM) hinzu pipettiert. Nach einer 30 minütigen Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock für 30 Sekunden bei 42 °C und anschließender
Inkubation für 5 Minuten auf Eis. Nach Zugabe von 300 µL LB-Medium ohne Selektionsdruck wurden die Zellen für 30 Minuten bei 37 °C und 150 rpm inkubiert. Der Ansatz wurde in sterilem LB-Medium um die Faktoren 1, 5 und 10 verdünnt und es wurden jeweils 200 µL der Verdünnungen auf den LB-Agar Platten mit Kanamycin ausgestrichen.
Nach der Inkubation für 24-48 Stunden bei 37 °C waren einzelne Plaques im Bakterienrasen zu erkennen.
Zur Transformation der E. coli JM 109 Zellen mit dem auf dem pBluescript II Vektor basierenden Phagemid pBSG74, das am Lehrstuhl für Biomolekulare Nanotechnologie der Technischen Universität München erstellt wurde, wurde folgendes Protokoll verwendet. Es wurde 1 µL Phagemid DNA (100 ng µL-1) zu 90 µL chemisch-kompetenten E. coli JM 109 Zellen gegeben und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der anschließende Hitzeschock erfolgte bei 42 °C für 60 Sekunden. Nach 2 Minuten auf Eis wurden 500 µL LB-Medium ohne Antibiotikum hinzu gegeben und die Zellen wurden für 60 Minuten bei 300 rpm inkubiert. Nach der Zentrifugation für 3 Minuten (1700 rcf, 20 °C) wurden 300 µL des Überstands verworfen. Die Zellen wurden in dem verbleibenden Überstand resuspendiert und 200 µL wurden auf LB-Agar Platten mit Carbenicillin ausgestrichen. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C waren transformierte Zellen als Kolonien erkennbar.