3. Eigene Untersuchungen
4.1 Mikrobiologische Untersuchungen
4.1.1 Vorversuche
Die Vorversuche, in denen die am besten praktizierbare Möglichkeit der Einmischung einer Listerien-Suspension (20 ml) in die Rohwurstgrundmasse erprobt wurde, erlaubten die Wahl einer Methode mit einem konstanten Verteilungsmuster der Bakterien als Methode für die Dotierung der Wurstgrundmasse in den Haupt-versuchen.
4.1.1.1 Verteilung der Listerien in der Wurstgrundmasse
Die Abbildung 5 zeigt das Verteilungsmuster von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) nach Einmischen mit zwei unterschiedlichen Methoden (V I und V II, s. Kapitel 3.3.1.1) in die Wurstgrundmasse nach einer Adaptationszeit von einer halben Stunde. Die Verteilung von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) ist für die verschiedenen Varianten (V I, V II) logarithmisch dargestellt. Auf der x-Achse ist die Anzahl der Proben aufgetragen, auf der y-Achse die Anzahl der KbE von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) (lg KbE/g) dargestellt.
Durch die einzelnen Punkte wurde zur Verdeutlichung eine Regressionsgrade (Reg.grd) gezogen, diese ist als Linie für beide Methoden (V I, V II) in der Grafik dargestellt.
Ergebnisse 79
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0 1 2 3 4 5 6 7
Proben
lg KbE/g
V I V II Reg.grd (V I) Reg.grd (V II)
Abb. 5: Anzahl der nachgewiesenen Listerien (Serovar 1/2a, DSM 20600) (lg KbE/g) in sechs Proben, gezogen an verschiedenen Lokalisationen der Wurstgrundmasse der beiden Einmischvarianten (V I, V II) nach Dotierung mit 1,0 x 104 KbE/g Wurst-masse und einer Adaptationszeit für die Bakterien (30 min.), Rgr.grd I und II = Regressionsgerade der Einzelwerte der jeweiligen Variante
Aus Abbildung 5 lässt sich ableiten, dass mittels der Einmischvariante II (V II) ein homogeneres Verteilungsmuster von Listeria monocytogenes in der Wurstgrund-masse (3000g) nach Dotierung mit einer Konzentration von 1,0 x 104 KbE/g (Listeria monocytogenes, DSM 20600, Serovar 1/2a) zu erreichen war. In Variante I (V I) waren bei den sechs untersuchten Proben im geometrischen Mittel lg 3,4 KbE/g Wurstgrundmasse nachweisbar, hier lag die Standardabweichung bei ± lg 0,56. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse der Variante II (V II). Im geometrischen Mittel lagen hier die Werte bei lg 2,8 KbE/g Wurstgrundmasse und die Standardab-weichung lag bei ± lg 0,20.
80 Ergebnisse
4.1.1.2 Verifizierung der Einmischvariante II (V II)
Um zu bestätigen, dass die Einmischung von Hand zur homogenen Verteilung der Bakterien genutzt werden kann, wurde der Versuchsaufbau der Variante II (V II) erneut durchgeführt und die Wurstgrundmasse sowohl mit 1,0 x 104 KbE/g Wurstmasse als auch mit 1,0 x 103 KbE/g Wurstgut beimpft. Das Verteilungsmuster von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) ist in Abbildung 6 dargestellt. Auf der x-Achse ist die Anzahl der Proben dargestellt, es wurden erneut je sechs Proben an sechs verschiedenen Lokalisationen der Wurstgrundmasse nach einer Adaptationszeit der Bakterien von 30 Minuten gezogen. Auf der y-Achse sind logarithmisch die KbE von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) je Gramm Wurstmasse (in lg KbE/g) aufgetragen. Für die einzelnen Punkte wurde eine Regressionsgrade (Reg.grd) errechnet und graphisch als Linie dargestellt.
Ergebnisse 81
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0 1 2 3 4 5 6 7
Proben
lg KbE/g
lg3 lg4 Reg.grd (lg3) Reg.grd (lg4)
Abb. 6: Verteilungsmuster von Listeria monocytogenes (Serovar 1/2a, DSM 20600) in der Rohwurstgrundmasse (sechs verschiedene Lokalisationen) nach Beimpfung mit 1,0 x 103 bzw. 1,0 x 104 KbE/g mittels Methode II (V II) nach Adaptationszeit für die Bakterien (30 min.), Rgr.grd lg3 und lg4 = Regressionsgerade der Einzelwerte der Variante II (V II) bei unterschiedlichen Konzentrationen
Aus Abbildung 6 wird ersichtlich, dass die Variante II (V II) ein homogenes Ver-teilungsmuster erzielte. Nach Beimpfung der Rohwurstgrundmasse mit L.m. mit 1,0 x 103 KbE/g Wurstgut liegen die Keimzahlen im geometrischen Mittel bei lg 2,61 KbE/g Rohwurstgrundmasse mit einer Standardabweichung von ± lg 0,08. Nach Dotierung der Wurstgrundmasse mit 1,0 x 104 KbE/g Wurstmasse steigen entsprechend die Werte bei den sechs Proben im Mittel auf lg 3,68 KbE/g Wurstgrundmasse, die Standardabweichung liegt hier bei ± lg 0,09. Aufgrund dieser Ergebnisse wird dieser Versuchsaufbau (V II) für die weiteren Hauptversuche als Methode der Wahl für die Einmischung der Bakteriensuspension gewählt.
82 Ergebnisse
4.1.1.3 Dichtebestimmung mittels Absorptionsmessung
Durch drei Versuchsreihen wurde das Verhältnis zwischen der Listerien-Konzen-tration (lg KbE/ml) und der Absorption bei 660 nm ermittelt. In Abbildung 7 ist die errechnete Regressionsgrade graphisch dargestellt. Auf der x-Achse ist die Gesamtkeimzahl (GKZ x 109/ml) angegeben und auf der y-Achse ist der Absorptionsfaktor bei 660 nm aufgezeigt. Die einzelnen Punkte in der Grafik geben jeweils die Einzelwerte aus den drei Versuchsreihen wieder. Die so erstellte Trendlinie diente als Berechnungsgrundlage für die Erstellung der Dotierungs-lösungen für die weiteren Versuche. Die Werte können den Tabellen 15, 16 und 17 im Anhang (Kapitel 10.1.2.) entnommen werden.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Absorption
GKZ x 109pro ml
Abb. 7: Abhängigkeit der Listerien-Konzentration (KbE/ml) und der Absorption bei 660 nm, = Trendlinie durch die Einzelwerte der drei Versuchsreihen
Ergebnisse 83
4.1.2 Hauptversuche
4.1.2.1 Feldstamm von Listeria monocytogenes
Die Abbildung 8 zeigt das Ergebnis der Polymerasekettenreaktion (PCR); diese wurde im Biozentrum für Mikrobiologie in Würzburg durchgeführt. Von sechs Isolaten eines Feldstammes, die zuvor aus Schweinehackfleisch isoliert worden waren, wurden drei Isolate (Isolate 3, 5 und 6) als Listeria monocytogenes bestätigt. Isolat 6 (Spur 7) wurde dann in den weiteren Versuchen als Impfstamm für die Dotierungs-lösungen verwendet.
750 bp
250 bp
500 bp
Spur 1: DNA Längenstandard 2: Isolat 1
3: Isolat 2 4: Isolat 3 5: Isolat 4 6: Isolat 5 7: Isolat 6
8: Referenzstamm L. monocytogenes EGDe
9: Negativkontrolle ohne DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abb.8: Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Oligonukleotidprimern Mono/MonoB und gelelektrophoretischer Längenbestimmung der Produkte in einem 1%-igen Agarosegel
84 Ergebnisse
4.1.2.2 Wiederfindungsrate nach Einmischung
In der folgenden Abbildung 9 ist die Wiederfindungsrate von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) nach Einmischung der Bakteriensuspension zu erkennen. Für die einzelnen Chargen wurden je fünf Kilogramm der Wurstgrundmasse hergestellt (s. Kapitel 3.1.1), diese dann mit jeweils 1,0 x 103 KbE Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) pro Gramm Rohwurstgrundmasse dotiert und mittels Einmischmethode II (V II) in die Wurstgrundmasse eingemengt (s. Kapitel 3.3.1.1).
Nach einer Adaptationszeit für die Bakterien von 30 Minuten sind jeweils drei Proben aus drei verschiedenen Lokalisationen der Wurstgrundmasse gezogen worden und die Verteilung von Listeria monocytogenes (KbE/g) wurde errechnet. Die Balken geben die logarithmierten Mittelwerte (MW) der drei gezogenen Proben der jeweiligen Charge wieder, die Standardabweichung ist jeweils durch eine Linie oberhalb des Balkens angegeben. Auf der x-Achse sind alle sechs Chargen im Vergleich graphisch dargestellt: C1 (0 Vol. % CO2/100 Vol. % N2), C2 (30 Vol. % CO2/70 Vol. % N2), C3 (60 Vol. % CO2/40 Vol. % N2), C4 (100 Vol. % CO2/0 Vol. % N2), C5 (100 Vol. % O2) und C6 (100 Vol. % Ar). Auf der y-Achse sind die kolonie-bildenden Einheiten (KbE) von Listeria monocytogenes logarithmisch aufgetragen (lg KbE/g). Die Einzelwerte der für diese Grafik verwendeten Mittelwerte sind der Tabelle 18 im Anhang (Kapitel 10.1.3.) zu entnehmen.
Ergebnisse 85
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Chargen
lg KbE/g
C1 C2 C3 C4 C5 C6
C1 C2 C3 C4 C5 C6
Abb. 9: Wiederfindungsrate von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) nach Beimpfung mit 1,0 X 103 KbE/g Wurstgrundmasse in den Chargen C1 bis C6 nach Adaptationszeit für die Bakterien von 30 Minuten
Aus der Abbildung 9 wird ersichtlich, dass durch das Untermengen der Listerien-Suspension (Feldstamm, Isolat 6) nach Variante II (V II) eine gleichmäßige Verteilung der Bakterien innerhalb der Rohwurstgrundmasse in allen sechs Chargen vorliegt. In Charge C1 (0 Vol. % CO2/100 Vol. % N2) sind im Mittel lg 2,26 KbE/g Listeria monocytogenes in der Wurstmasse nachweisbar, die Standardabweichung liegt hier bei ± lg 0,12, in Charge C2 (30 Vol. % CO2/70 Vol. % N2) liegen die Keim-zahlen bei lg 2,26 KbE/g mit einer Standardabweichung von ± lg 0,11. Charge C3 (60 Vol. % CO2/40 Vol. % N2) zeigt im Mittel eine Konzentration von Listeria monocy-togenes von lg 2,17 KbE/g, die Standardabweichung liegt hier bei ± lg 0,02, in Charge C4 (100 Vol. % CO2/0 Vol. % N2) sind lg 2,07 KbE/g mit einer Standard-abweichung von ± lg 0,01 nachweisbar. Lediglich in den Chargen C5 (100 Vol. % O2) und C6 (100Vol. % Ar) liegen die nachweisbaren Keimzahlen etwas höher. In Charge
86 Ergebnisse
C5 sind lg 3,01 KbE/g Wurstmasse nachweisbar, die Standardabweichung liegt bei
± lg 0,02 und in Charge C6 liegt die Wiederfindungsrate bei lg 2,96 KbE/g Rohwurstgrundmasse mit einer Standardabweichung von ± lg 0,06. Die Beimpfung dieser beiden Chargen wurde ebenfalls unter gleichen Herstellungsbedingungen wie bei den anderen Chargen mit einer Konzentration von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) mit 1,0 x 103 KbE/g Wurstgrundmasse durchgeführt, aber zu einem anderen Zeitpunkt.
4.1.2.3 Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl über 21 Tage Lagerungszeit
Die Abbildung 10 zeigt die aeroben mesophilen Gesamtkeimzahlen (GKZ) aller Chargen (C1 bis C6) über einen Zeitraum von 21 Tagen. In dieser Grafik sind die Wachstumsverläufe für jeden Untersuchungstag als Balkendiagramm dargestellt. Auf der x-Achse ist die Zeit in Untersuchungstagen aufgeführt, jede Charge (C1 - C6) wird durch einen Balken dargestellt. Auf der y-Achse ist der Mittelwert der Anzahl der mesophilen aeroben Keime logarithmisch angegeben (lg KbE/g). Die ermittelten Einzelwerte sind in Tabelle 19 im Anhang (Kapitel 10.1.4.) aufgeführt. Die Standard-abweichungen sind jeweils als Linien oberhalb der einzelnen Balken verzeichnet.
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Balken zeigen statistisch signifikante Unterschiede der Chargen zueinander (p ≤ 0,05) an den jeweiligen Untersuchungs-tagen.
Ergebnisse 87
Abb. 10: Verlauf der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl (lg KbE/g; MW, ± S) in den Chargen C1 bis C6 (je n=6) über einen Untersuchungszeitraum von 21 Tagen, unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Balken = signifikante Unterschiede der Chargen zueinander (p ≤ 0,05) an den jeweiligen Untersuchungstagen
Aus dieser Grafik wird ersichtlich, dass die mesophile aerobe Gesamtkeimzahl (GKZ) in allen Chargen bis zum Tag 16 statistisch signifikant (p ≤ 0,05) ansteigt. Charge C3 (60 Vol. % CO2/40 Vol. % N2) und Charge C4 (100 Vol. % CO2/0 Vol. % N2) zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen den einzelnen Untersuchungstagen im Wachstumsverslauf bis zum Tag 21. Weiterhin wird deutlich, dass Charge C5 (100 Vol. % O2) sich im Wachstumsverlauf der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl (GKZ) an den jeweiligen Untersuchungstagen statistisch signifikant (p ≤ 0,05) von den übrigen Chargen unterscheidet. Charge C5 zeigt an allen Tagen einen statistisch signifikant höheren Keimgehalt als die Chargen C1 bis C6. Lediglich
88 Ergebnisse
am Untersuchungstag 4 ist zwischen Charge C5 und Charge C6 (100 Vol. % Ar) kein signifikanter Unterschied zu erkennen.
In Charge C5 (100 Vol. % O2) steigt die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl von anfangs im Mittel lg 5,58 KbE/ g Wurstmasse auf lg 7,6 KbE/ g an Untersuchungstag 21. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse der übrigen Chargen. Die Chargen C1 (0 Vol. % CO2/100 Vol. % N2), C2 (30 Vol. % CO2/70 Vol. % N2), C3 (60 Vol. % CO2/40 Vol. % N2), C4 (100 Vol. % CO2/0 Vol. % N2) und C6 (100 Vol. % Ar) zeigen im Wachstumsverlauf einen Anstieg der Keimzahlen auf Konzentrationen, die knapp unterhalb von lg 7,0 KbE/ g liegen. In den Chargen C1 bis C4 ist zwischen den unterschiedlichen CO2-Konzentrationen (von 0 Vol. % bis 100 Vol. %) an den jewei-ligen Untersuchungstagen kein Unterschied im Wachstumsverhalten der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl zu erkennen.
4.1.2.4 Quantitativer Nachweis von Listeria monocytogenes über 21 Tage Lage-rungszeit
Abbildung 11 zeigt die Keimzahlen von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) als Mittelwerte der erhobenen Einzelwerte (s. Tab. 20, Kapitel 10.1.5. im Anhang) in kurzgereifter Rohwurst über einen Zeitraum von 21 Tagen mit Probenahme an den Tagen 0, 4, 8, 12, 16 und 21 in den Chargen C1 bis C6. Auf der x-Achse sind die Untersuchungstage aufgezeigt, auf der y-Achse ist die Anzahl von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) logarithmisch dargestellt (lg KbE/g). Für Tag 0 konnte keine statistische Auswertung durchgeführt werden.
Ergebnisse 89
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0 4 8 12 16 21
Untersuchungstag
lg kbE/g
C1 C2 C3 C4 C5 C6
Abb. 11: Verlauf der nachweisbaren Keimzahlen (MW) von Listeria monocytogenes in kurzgereifter Rohwurst (C1 bis C6, je n=6) über einen Zeitraum von 21 Tagen, ausgefüllte bzw. grau unterlegte Symbole = signifikante Tagesunterschiede innerhalb der Chargen (p ≤ 0,05)
Aus diesem Diagramm lässt sich erkennen, dass die Keimzahlen von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) in den Chargen C1 (0 Vol. % CO2/100 N2), C2 (30 Vol. % CO2/70 Vol. % N2), C4 (100 Vol. % CO2/0 Vol. % N2) und in Charge C6 (100 Vol. % Ar) keine statistisch signifikanten Änderungen (p ≤ 0,05) über den gesamten Untersuchungszeitraum von 21 Tagen aufweisen. Innerhalb der einzelnen Chargen lassen sich statistisch signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen einzel-nen Untersuchungstagen erkeneinzel-nen, die aber über den Verlauf insgesamt keine Aussage treffen lassen, sondern lediglich deskriptiv ausgewertet werden können.
Lediglich in Charge C3 (60 Vol. % CO2/40 Vol. % N2) und Charge C5 (100 Vol. % O2) sind statistisch signifikante Änderungen in der Anzahl von Listeria monocytogenes
90 Ergebnisse
(Feldstamm, Isolat 6) zu erkennen. In Charge C3 kann ein statistisch signifikanter Abfall in den Keimzahlen von im Mittel lg 2,26 KbE/g zu Anfang auf Werte von lg 1,77 KbE/g Wurstmasse festgestellt werden. Charge C5 zeigt einen deutlichen Rückgang der Anzahl der Keime von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6, in lg KbE/g).
Die Keimzahlen sinken in Charge C5 von anfangs lg 3,01 KbE/g im Mittelwert (MW) auf lg 2,18 KbE/g an Untersuchungstag 16; an Untersuchungstag 21 ist dann ein erneuter leichter Anstieg der Keimzahlen auf Werte von lg 2,31 KbE/g Wurstmasse zu erkennen.
Abbildung 12 zeigt ebenfalls die Anzahl der Keime von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) über einen Zeitraum von 21 Tagen mit Probennahme an den Tagen 0, 4, 8, 12, 16 und 21 in den Chargen C1 bis C6. In dieser Grafik sind die Wachstumsverläufe für jeden Untersuchungstag als Balkendiagramm dargestellt, um die Unterschiede der Chargen zueinander zu verdeutlichen. Auf der x-Achse ist die Zeit in Untersuchungstagen aufgeführt, jede Charge (C1 bis C6) wird durch einen Balken an dem jeweiligen Untersuchungstag repräsentiert, auf der y-Achse ist die Anzahl von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) logarithmisch angegeben (lg KbE/g). Die Standardabweichungen sind jeweils als Linien oberhalb der einzelnen Balken verzeichnet. Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Balken zeigen zusätzlich statistisch signifikante Unterschiede der Chargen zueinander (p ≤ 0,05) an den jeweiligen Untersuchungstagen. Für Untersuchungstag 0 konnte keine statis-tische Auswertung erfolgen.
Ergebnisse 91
Abb. 12: Keimzahlen (MW, +S) von Listeria monocytogenes (Feldstamm, Isolat 6) über 21 Tage in den Chargen C1 bis C6 (je n=6), mit Probennahme an den Tagen 0, 4, 8, 12, 16 und 21; unterschiedliche Buchstaben = signifikante Unterschiede der Chargen zueinander (p ≤ 0,05) an den jeweiligen Untersuchungstagen
Die Werte der Chargen C5 (100 Vol. % O2) und C6 (100 Vol. % Ar) liegen im Mittel höher als die Werte der übrigen Chargen (lg 3,01 KbE/g in C5, lg 2,96.KbE/g in C6).
Da diese an unterschiedlichen Tagen hergestellt wurden, konnten statistisch signifikante Unterschiede der Chargen zueinander lediglich zwischen den Chargen C1 bis C4 und den Chargen C5 und C6 errechnet werden. Bemerkenswert ist, dass die Keimzahlen der Charge C5 an Tag 0 höher liegen als in Charge C6, ab Tag 4 dann aber im weiteren Verlauf unter die Werte der Keimzahlen der Charge C6 fallen.
Bei den Chargen C1 bis C4 liegen die Anfangskeimgehalte bei Werten um lg 2,2 kbE/g bis lg 2,5 KbE/g. Im weiteren Verlauf zeigen die Keimzahlen in diesen Chargen keine Kontinuität. Zwischen den einzelnen Chargen liegen an einzelnen Tagen
92 Ergebnisse
statistisch signifikante (p ≤ 0,05) Unterschiede vor, aber es lässt sich keine Regelmäßigkeit ableiten.