Diskussion von Material und Methoden

5.2.1 Material

5.2.1.1 „Frische Mettwurst“

Die in den Versuchen verwendete Wurstgrundmasse wurde nach Art einer „Frischen Mettwurst“ (Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse, 2.212.3) hergestellt. Dabei wurden 80 % grob entfettetes Schweinefleisch (Mm. Semimembranosus, semiten-dinosus u. glutaeus medius) und 20 % Fettgewebe vom Schwein zu einer Grund-masse verarbeitet. Um die Auswirkungen der Schutzgase an sich auf das Wachstumsverhalten der Testkeime untersuchen zu können, wurde außer auf die Zugabe von 1,8 % Nitritpökelsalz (NPS) auf weitere Zusätze wie Starterkulturen und Gewürze bei der Herstellung der Rohwurstgrundmasse verzichtet, da in diversen Untersuchungen ein keimhemmender Effekt von Starterkulturen auf Listeria monocytogenes nachgewiesen werden konnte. Kulturen mit beispielsweise 50 % Lactobacillus plantarum und 50 % Lactobacillus carnis zeigten deutliche Hemm-wirkung auf Listeria monocytogenes (OZARI 1991). Auch KULEASAN und CAKMAKCI (2002) bestätigen diese Beobachtungen. Listeria monocytogenes konnte durch das von Lactobacillus reuteri produzierte Bacteriocin Reuterin im Wachstum

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gehemmt werden. Insgesamt wurden 180 Proben, je Charge 36 Proben à 125 g, in einem Untersuchungszeitraum von 21 Tagen untersucht.

5.2.1.2 Mikroorganismen

In den Vorversuchen wurde ein humanpathogener Referenzstamm von Listeria monocytogenes Serovar 1/2a (DSM 20600) eingesetzt. In den weiteren Haupt-versuchen wurde dann ein Feldstamm von Listeria monocytogenes verwendet, um die natürlichen Verhältnisse des Vorkommens der Listerien zu reproduzieren. Der verwendete Feldkeim war zuvor aus Schweinehackfleisch isoliert worden, im Labor des Institutes für Lebensmittelqualität und –sicherheit angezüchtet und dann durch spezifische Untersuchungen als Listeria monocytogenes identifiziert worden. Eine zusätzliche Bestätigung wurde in einem unabhängigen Labor, im Biozentrum für Mikrobiologie in Würzburg, mittels PCR durchgeführt. Der Feldstamm wurde als Testkeim für die Hauptversuche eingesetzt, da die Bakterien bereits an die Matrix Schweinefleisch adaptiert waren. Bakterien besitzen die Fähigkeit, sich ihrer Um-gebung anzupassen. Untersuchungen ergaben, dass die Fähigkeit zum Wachstum in einer Umgebung, an die die Keime nicht adaptiert sind, reduziert ist (DYKES 2003).

5.2.1.3 Verpackung

Ein Großteil aller Lebensmittel, darunter auch Fleisch und Fleischerzeugnisse, gelangt heutzutage verpackt in den Handel, die MAP-Technologie kommt dabei vermehrt zum Einsatz (FARBER 1990). Die Zusammensetzung der Verbundmate-rialien hat dabei einen direkten Einfluss auf die erwünschten Eigenschaften der Verpackung. In der Regel werden Schalen aus Polypropylen (PP), aus geschäumtem Polystyrol (PS) sowie aus Polyethylenterephthalat (PET) verwendet. Polyethylen (PE) mit unterschiedlichen Dichtegraden wird als Folienmaterial ebenso wie Polysterol (PS) oder Polyvinylchlorid (PVC) eingesetzt. Zusätzlich wird

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weise Polyvinylidenchlorid (PVDC) als Barriereschicht gegen Sauerstoff eingesetzt (ANONYM 2006). Um die Versuche in Anlehnung an die im Handel verwendeten Verpackungen zu gestalten, wurden auch in den vorliegenden Untersuchungen diese Verpackungsmaterialien verwendet. Zum Einsatz kam eine Schale aus Polypropylen (PP) in Kombination mit einer PET-Folie mit einer Barriereschicht aus PVDC. Im Handel sind noch keine Verpackungsmaterialien für die Verpackung von „Frischer Mettwurst“ ohne Hülle, also unter Schutzatmosphäre, vorhanden. Da bei der MAP-Technologie ein häufiger Fehler im Volumenverhältnis Gas zu Produkt liegt (ANONYM 2003), wurde die Verpackung für praxisübliche Anwendungen nach-geahmt. Hackfleisch wird handelsüblich zu 250 g Portionen in einer MAP-Schale (187 x 137 x 50mm) verpackt, deshalb wurden in der vorliegenden Studie in Anlehnung daran je zwei Würste à 125g gemeinsam in einer solchen MAP-Schale unter Schutzatmosphäre verpackt. Dabei liegt das Inhalt/Gasvolumen-Verhältnis etwa bei 1:1,6.

5.2.1.4 Schutzgase

Bei der MAP-Technologie wird die Umgebungsluft durch eine definierte, auf das Lebensmittel abgestimmte Schutzatmosphäre ersetzt. Je nach Produktgruppe wer-den verschiewer-dene Gasatmosphären eingesetzt. Für frisches Fleisch ist dabei eine Sauerstoff enthaltende Atmosphäre notwendig, da dieser sich mit dem Muskel-farbstoff Myoglobin zu Oxymyoglobin verbindet und so die rote Fleischfarbe länger erhalten bleibt (FARBER 1990, CHURCH u. PARSONS 1997). Für die Verpackung von Frischfleisch sind Gasgemische von 60 bis 80 Vol. % Sauerstoff (O2) und 20 bis 40 Vol. % Kohlendioxid (CO2) üblich. Im Gegensatz zur Frischfleischverpackung, werden oxidativ gefährdete Lebensmittel wie beispielsweise Aufschnittware von Mortadella oder Salami, in der Regel unter anaeroben Verhältnissen verpackt (DEVLIEGHERE et al. 2004). Dazu werden in der Regel Mischungen von Stickstoff (N2) oder anderen inerten Gasen mit Kohlendioxid (CO2) verwendet (ANONYM 2006). Da ein Produkt wie „Frische Mettwurst“ umgerötet ist und somit kein

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Sauerstoff zur Erhaltung der roten Farbe notwendig ist, kann dieses Produkt ebenfalls in einer Atmosphäre ohne Sauerstoff verpackt werden. Die „Frische Mettwurst“ wurde in den vorliegenden Untersuchungen unter einer anaeroben Atmosphäre aus Kohlendioxid (CO2) und Stickstoff (N2) verpackt. In Anlehnung an die Frischfleischverpackung (30 Vol. % CO2) wurden hier die beiden Gase als Gasgemisch in gleichmäßigen Abstufungen eingesetzt. Die Gasanteile wurden in den Abstufungen 100, 60, 30 und 0 Vol. % CO2 verwendet, die Restanteile auf 100 Vol. % bildete jeweils N2. Die Stufen sollten zur Ermittlung des optimalen Mischungs-verhältnisses der Gase dienen. Zwei weitere Chargen mit 100 Vol. % Sauerstoff und 100 Vol. % Argon wurden ebenfalls in dieser Studie untersucht. Nach FARBER (1990) fördert O2 generell das Wachstum der aeroben Keimflora, hemmt aber gleichzeitig das Wachstum der obligat anaeroben Keime. Daher sollte die vorliegende Studie Aufschluss über die Effekte von 100 Vol. % O2 sowohl auf das Keimwachstum der mesophilen aeroben Mikroflora als auch auf Listeria monocytogenes geben. Argon als ein inertes Gas wurde in Anlehnung an die Verwendung von 100 Vol. % Stickstoff eingesetzt und untersucht, um eventuelle antimikrobielle Wirkungen, wie bei ENFORS et al (1979) beschrieben, auf die Gesamtkeimzahl und Listeria monocytogenes feststellen zu können.

5.2.1.5 Lagerung

„Frische Mettwurst“ ist als kurzgereifte Rohwurst nach den Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse (2.21) ungekühlt (über 10 °C) lagerungsfähig. Das Produkt wird normalerweise bei 7 °C gereift und gelangt dann in den Handel. Aufgrund des frischen Charakters, d. h. da „Frische Mettwurst“ durch die geringe Abtrocknung höhere pH- und aw-Werte (BUCKENHÜSKES u. GEHRING 2000) aufweist und dadurch die Gefahr des mikrobiellen Verderbs erhöht ist, sollte die Lagerung auch im Handel bei Kühltemperaturen von etwa 7°C stattfinden. SZABO u. CAHILL (1998) beobachteten in ihrer Studie mit beimpfter Trypton-Soja-Bouillon eine Vermehrung von Listeria monocytogenes während der Lagerung sowohl bei 4 °C als auch bei

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12 °C. In ihrer Studie wurde der Einfluss von 100 Vol. % CO2 bzw. 100 Vol. % N2 als Schutzgase mit berücksichtigt. Die Vermehrungsrate der Keime lag in beiden untersuchten Atmosphären bei 12 °C weit höher als bei 4 °C. Selbst bei Kühlschranktemperaturen ist eine Vermehrung der Keime zwar möglich, aber sowohl die lag-Phase als auch die Generationszeiten von Listeria monocytogenes zeigen bei Temperaturen unter 10 °C signifikante Verzögerungen (HARRIS 2002). Um die Verhältnisse der Lagerung im Handel mit berücksichtigen zu können, wurde in der vorliegenden Studie die „Frische Mettwurst“ sowohl bei 7 ± 0,2 °C gereift als auch über einen Zeitraum von 21 Tagen bei einer konstanten Temperatur von 7 ± 0,2 °C gelagert.

5.2.2 Methoden

5.2.2.1 Verteilung der Listerien in der Wurstgrundmasse

Eine homogene Verteilung von Listeria monocytogenes nach Dotierung der Rohwurstgrundmasse war für den weiteren Versuchsaufbau eine grundlegende Vorraussetzung. Sollen für eine Dotierung niedrige Keimzahlen verwendet werden, so besteht das Problem der homogenen Verteilung der Keime im Untersuchungsgut.

Der Wert einer Studie kann bei inhomogener Verteilung der Listerien beeinträchtigt werden. Daher wurde in den Vorversuchen mittels zweier Einmischvarianten (V I, V II) die Variante mit dem homogeneren Verteilungsmuster (V II) von Listeria mono-cytogenes als Methode der Wahl für die Hauptversuche ausgewählt. Im Vergleich zum Einmischen per Rührmaschine konnte mittels Untermengen von Hand eine homogene Verteilung der Listerien-Suspension in der Rohwurstgrundmasse erreicht werden. Weiterhin veränderte sich bei Untermengen mit der Rührmaschine die Textur des Endproduktes erheblich, was auf die Erhöhung der Temperatur der Wurstgrundmasse durch die Reibungswärme bei dem Rührvorgang zurückzuführen war. Nachdem das Ausgangsmaterial aus dem Fleischwolf entnommen wurde,

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betrug die Temperatur der Wurstmasse im Mittel 7,5 °C, nach Dotierung mit Listeria monocytogenes und nach folgender Behandlung mit der elektrischen Rührmaschine konnte eine Temperaturerhöhung auf 22 °C festgestellt werden. Im Vergleich dazu führte die Einmischung der Bakteriensuspension durch Untermengen von Hand zu einer Erhöhung der Temperatur um lediglich 2 °C und eine Veränderung der Textur des Endproduktes konnte nicht festgestellt werden. Einmischvariante V II wurde aus diesen Gründen für die weiteren Versuche zum Untermengen der Dotierungs-suspension gewählt. Als Testkeim wurde in den Vorversuchen für die Dotierung der Wurstgrundmasse ein humanpathogener Referenzstamm Listeria monocytogenes Serovar 1/2a (DSM 20600) eingesetzt. Damit war sichergestellt, dass durch die Wahl eines nicht adaptierten Stammes der „worst case“ im Verteilungsmuster gegeben war. In den späteren Hauptversuchen wurde ein Feldstamm von Listeria monocy-togenes zur Dotierung verwendet (s. Kapitel 5.2.1.2).

5.2.2.2 Kulturelle Nachweismethode

Die quantitative Bestimmung der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl (GKZ) sowie die quantitative und qualitative Untersuchung der einzelnen Proben auf Listeria monocytogenes wurde gemäß der Referenzmethode nach § 64 LFGB (L 06.00-18, L 00.00-22, L 00.00-32) durchgeführt. Demnach dienen als selektive Nährböden der OXFORD-Agar und der PALCAM-Agar (CURTIS et al. 1989). Durch diese Nähr-medien ist allerdings eine Unterscheidung zwischen apathogenen und pathogenen Spezies des Genus Listeria allein nicht möglich (REISSBRODT 2004). Für eine weitere Spezifizierung sind daher zusätzliche Untersuchungen nötig, die einen erheblichen Mehraufwand sowohl zeitlich als auch finanziell bedeuten. Bei den konventionellen Methoden liegt ein Ergebnis in vielen Fällen erst nach drei bis fünf Tagen vor. Eine gute Möglichkeit bietet deshalb die Verwendung eines Selektivmediums, welches in der Lage ist, eine direkte Unterscheidung zwischen apathogenen und pathogenen Listeria-Spezies (GREENWOOD et al. 2005) zu treffen und welches leicht abzulesen ist. Eine Identifizierung von Listeria

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cytogenes mit Hilfe von chromogenen Nährmedien ist bereits nach 24 Stunden möglich (REISSBRODT 2004; GREENWOOD et al. 2005). In den letzten Jahren wurden deshalb verschiedene Nährmedien entwickelt, die einen Nachweis der pathogenen Spezies Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii aufgrund des typischen Enzymmusters im Vergleich zu den apathogenen Spezies erlauben. Auf dem in diesen Untersuchungen verwendeten OCLA-Agar wachsen sowohl die apa-thogenen als auch die paapa-thogenen Stämme als türkise Kolonien, eine Unterschei-dung kann anhand des opaken Hofes, der durch die Aktivität der Phospholipase C der pathogenen Stämme Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii entsteht, getroffen werden. Daher wurde in der hier vorliegenden Studie der OCLA-Agar für die Identifizierung von Listeria monocytogenes verwendet. Der dabei eingesetzte Feldstamm wurde als Listeria monocytogenes identifiziert und von einem unabhängigen Labor als solches bestätigt (Biozentrum Würzburg). Weiterhin konnte durch den qualitativen Nachweis auf Listeria monocytogenes in der Wurstgrund-masse eine vorherige Kontamination mit Listeria ssp. ausgeschlossen werden, so dass bei den auf dem Selektivmedium nachgewiesenen Kolonien mit Hofbildung von Listeria monocytogenes ausgegangen werden konnte.

5.2.2.3 Physikalische Untersuchungen

5.2.2.3.1 pH- und aw-Wert-Messungen

Aufgrund der geringen Abtrocknung der „Frischen Mettwurst“ während der Reifephase wird bei diesem Produkt eine Stabilisierung im mikrobiologischen Sinne lediglich über den pH-Wert bzw. die aw-Wert-Absenkung erreicht (LEISTNER 1985).

Eine Absenkung des pH-Wertes kann also die Haltbarkeit dieses Produktes verbessern (BUCKENHÜSKES u. GEHRING 2000). Durch die Verwendung von Kohlendioxid (CO2) als Schutzgas kann durch die Löslichkeit des Gases in der wässrigen Phase des Fleisches bzw. Fleischerzeugnisses eine leichte

pH-Wert-Diskussion 117

Absenkung erfolgen und so zu einer Säuerung des Produktes führen (FARBER 1990; DEVLIEGHERE et al. 2000). Im Rahmen der hier vorliegenden Untersuchungen wurden deshalb an allen Untersuchungstagen pH- und aw -Wert-Messungen zur Kontrolle durchgeführt.

5.2.2.3.2 Farbmessung

Eine ansprechende Farbe des Fleisches bzw. des Fleischerzeugnisses vermittelt dem Verbraucher den Eindruck eines frischen Produktes mit Eigenschaften wie Zartheit, Schmackhaftigkeit und Frische (FARBER 1990; ISSANCHOU 1996). Somit ist die Farbe für den Verbraucher ein wichtiges, aber sehr subjektives Qualitäts-kriterium für ein Produkt. Ein Farbmessgerät dagegen liefert numerische Daten auf der Basis von internationalen Standards (FREUDENREICH u. SCHÜßLER 2001).

Um die Auswirkungen der unterschiedlichen Gase auf die Farbe des Produktes

„Frische Mettwurst“ objektiv betrachten zu können, wurde in der vorliegenden Studie an allen Untersuchungstagen die Farbe mittels eines Spektrophotometers gemessen.

5.2.2.4 Chemische Untersuchungen

Die chemische Bestimmung von Trockensubstanz, Asche, Gesamtfett, Eiweiß und Hydroxyprolin wurde jeweils zu Beginn und zum Ende der Untersuchungen durchgeführt, um eventuelle Effekte der Lagerung unter Schutzatmosphäre auf die chemische Zusammensetzung des Produktes „Frische Mettwurst“ feststellen zu können. Mittels Nitrit- und Nitratmessung und durch die Bestimmung der Umrötung an allen Untersuchungstagen sollte festgestellt werden, ob sich die verschiedenen Schutzgase auf diese Parameter auswirken. Bei der Herstellung von Rohwurst ist der Nitritgehalt besonders zu Beginn der Reifung von Bedeutung (HECHELMANN 1985;

WEBER 1996). Nitritpökelsalz wird für die Umrötung und damit zur Stabilisierung der

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Fleischfarbe eingesetzt, da ohne Pökelstoffe die Wurst nicht die erwünschte pökelrote Farbe bekommt (CORETTI 1974).