Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren

2.2.1.1 Isolierung von Plasmid DNA (Sambrook et al., 1989)

2.2.1.1.1 Minipräparation von Plasmid-DNA

Diese Methode dient der schnellen Isolierung kleiner Mengen Plasmid-DNA, wobei die Qualität der DNA für eine Restriktionsanalyse sowie für die Sequenzierung ausreichend ist. 5 ml LB-Medium (mit 50 µg/ml Antibiotikum) wurden mit einer Einzelkolonie angeimpft und üN bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Aus 600 µl der Kultur wurde mit 200 µl Glycerin ein Stock angelegt und dieser bei -80°C aufbewahrt. Der Rest der Bakteriensuspension wurde bei 4000x g für 15 min auf 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 100 µl Resuspension-Lösung (P1) wieder in Lösung gebraucht und in ein Eppendorfgefäß transferiert. Der Aufbruch der Zellen erfolgte durch Zugabe von 200 µl Lysispuffer (P2). Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei RT wurde die Suspension mit 150 µl Neutralisierungspuffer (P3) gemischt. Die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation bei 12000x g für 15 min pelletiert, der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die Zentrifugation wiederholt. Die obere Phase wurde abgenommen und in ein frisches Eppendorfgefäß überführt. Die Fällung der Plasmid-DNA erfolgte durch Zugabe von 2.5 Vol. 100% Ethanol für 30 min bei 4°C. Durch den anschließenden Zentrifugationsschritt mit 12000x g für 30 min bei RT wurde die DNA pelletiert, das Pellet mit 70%-igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 30 µl H₂O aufgenommen.

2.2.1.1.2 Endotoxin-freie Maxipräparation von Plasmid-DNA

Für die Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen wurde das Plasmid mit dem EndoFree Plasmid Maxi-Kit (Qiagen, Hilden) Endotoxin-frei präpariert. Dazu wurden 100 ml üN-Bakterienkultur abzentrifugiert und mittels alkalischer Lyse aufgeschlossen.

Zelltrümmer, Proteine und Salzkomplexe wurden durch Filtration in der QIAfilter Maxi Cartridge abgetrennt, das Lysat über eine äquilibrierte Säule gegeben, die gebundene DNA gewaschen und in ein steriles, Endotoxin-freies Zentrifugenröhrchen aus Glas eluiert. Nach der Präzipitation mit 0.7 Vol. Isopropanol wurde das Pellet mit 70%igem EtOH (hergestellt mit Endotoxin-freiem H2O aus dem Kit) gewaschen, luftgetrocknet und in 100–200 µl ebenfalls Endotoxin-freiem TE-Puffer aufgenommen.

2.2.1.2 Isolierung genomischer DNA aus Geweben (Laird et al., 1991)

Die Isolierung genomischer DNA aus Schwanzspitzen von Mäusen bzw. aus Gewebe für eine anschließende Genotypisierung wurde nach der Methode von Laird et al., (1991) durchgeführt. Hierbei bleibt die DNA durch eine Behandlung mit Proteinase K vor dem Verdau durch endogene Nukleasen geschützt.

0.5 cm der Schwanzspitze von etwa 3 Wochen alten Mäusen bzw. 1 bis 2 g Gewebe wurden in 700 µl Lysis-Puffer unter Zugabe von 35 µl Proteinase K (10 µg/µl) bei 55°C üN unter Schütteln inkubiert. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die DNA mit 0.7 Vol. Isopropanol bei RT präzipitiert und durch eine anschließende Zentrifugation mit 12000x g bei RT für 10 min pelletiert. Nach einem Waschschritt mit 500 µl 70%igem Ethanol wurde das DNA-Pellet in 100-200 µl H₂O bei 60°C gelöst und bis zur Analyse bei 4°C gelagert.

2.2.1.3 Isolierung genomischer DNA aus ES-Zellen

Die 24 Well-Platten mit den Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 500 µl ES-Lysispuffer pro ES-Zellklon üN bei 37°C inkubiert. Nach erfolgter Zelllyse wurde die

danach vorsichtig entfernt. Nach dem Waschen mit 1 ml 70%igem Ethanol wurde die DNA in 80 µl TE-Puffer aufgenommen. Die DNA wurde bei offenem Deckel bei 60°C für 15 min gelöst und dabei noch vorhandene Ethanolrückstände verdampft. Die genomische DNA konnte nun restriktionsenzymatisch geschnitten, über ein analytisches Agarosegel aufgetrennt und einem Southern-Transfer unterworfen werden.

2.2.1.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben

Alle für die Experimente mit RNA benutzen Glaswaren und Lösungen wurden mit 0.1%igem DEPC für 12 h behandelt, um sie von RNasen zu befreien. Zur Zerstörung des DEPC wurde anschließend für 20 min autoklaviert. Alle Glaswaren wurden für mehrere Stunden bei ca. 200°C sterilisiert. Bei der Gewebepräparation wurde mit Handschuhen gearbeitet und das frisch präparierte Gewebe bis zur RNA-Isolierung bei -80°C gelagert. Die Arbeitsschritte wurden nach Möglichkeit auf Eis oder im Kühlraum durchgeführt.

2.2.1.4.1 Isolierung von RNA durch Fällung

(modifiziert nach Chomczynski und Sacchi, 1987)

100 mg frisches Gewebe wurde in 1 ml Total RNA Isolation Reagent (Biomol, Hamburg) gegeben, mit einem Glas-Teflon Werkzeug homogenisiert und die Suspension 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 0.2 Vol. vorgekühltem Chloroform wurde der Ansatz vorsichtig geschwenkt und für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Die Probe wurde dann mit 12000x g bei 4°C für 15 min zentrifugiert, der wässrige Überstand wurde zur Fällung der RNA mit 0.6 Vol. Isopropanol auf Eis für 10 min inkubiert und die RNA anschließend durch Zentrifugation (20 min, 4°C, 10000x g) pelletiert. Danach wurde das RNA-Pellet in 70% Ethanol resuspendiert, erneut sedimentiert und in DEPC-H₂O gelöst. Die isolierte RNA konnte für reverse Transkriptase-Reaktionen und Northern Blot-Analysen eingesetzt werden. Nach der Konzentrationsbestimmung wurde die RNA in 20 µg-Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.

2.2.1.4.2 Isolierung von RNA über die Säule

Um geringe Mengen RNA z. B. für eine RT-PCR aus wenig Gewebe zu erhalten, wurde eine Präparation mit dem RNeasy Mini Kit von Qiagen vorgenommen. Hierzu wurden 30 mg Gewebe in 600 µl RLT-Puffer (beinhaltet β-Mercaptoethanol) mit einem Glas-Teflonwerkzeug homogenisiert, auf eine QIAShredder-Säule mit Sammelgefäß überführt und bei 12000x g bei RT für 2 min zentrifugiert. Zur Pelletierung der in das Filtrat gelangten Verunreinigungen wurde das Filtrat 3 min zentrifugiert. Zum Überstand wurde 1 Vol. 70%iges Ethanol gegeben, die Lösung auf die RNeasy mini Spin-Säule überführt und 30 s mit 8000x g bei RT zentrifugiert. Die in dem Filter gebundene RNA wurde erst mit 700 µl RW1-Puffer und danach 2x mit 500 µl RPE-Puffer durch 30 s Zentrifugieren gewaschen. Die Trocknung der Membran erfolgte durch 2 min zentrifugieren mit 8000x g bei RT. Zum Schluss wurde die RNA mit 50 µl RNase-freiem H₂O aus dem Filter eluiert. Die Konzentration betrug 0.3-1.5 µg/µl.