Expression des Insl6-Gens bei der Maus

Das Insl6-Gen wird bei der adulten Maus ausschließlich im Testis exprimiert (Lok et al., 2000). Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitere Experimente zur Analyse der Expression des Insl6-Gens durchgeführt.

3.2.1.1 Herstellung der Insl6-cDNA der Maus mittels RT-PCR

Die Expression des Insl6-Gens in verschiedenen Geweben wurde mittels Northern-Blot und RT-PCR untersucht.

Für die Expressionsexperimente mussten zunächst die entsprechenden Sonden für die Hybridisierungen hergestellt werden. Die Insl6-cDNA wurde durch RT-PCR mit Insl6 spezifischen Primern amplifiziert. Für die cDNA-Synthese wurde 1 µg Gesamt-RNA aus Testis einer adulten Maus mit dem One-Step RT-PCR-Kit umgeschrieben. Nach der Klonierung in den Vektor pGEM-T^® Easy wurde das PCR-Produkte sequenziert. Durch Vergleich der Nukleotidsequenz des cDNA-Klons mit Insl6-cDNA in der Datenbank konnte eine Homologie von 100% innerhalb der entsprechenden Bereiche der cDNA festgestellt werden (Abb. 3.13).

Insl6-R1 ATG TAA

1 2

Insl6-F2

Genomisch: >3.8 kb cDNA: 580 bp

Abb. 3.13: Schema und Primerpositionen für die durchgeführte RT-PCR. . Die PCR wurde so geplant, dass das PCR-Produkt eine Länge von 580 bp hat und die Sequenz beider Exons von Insl6 beinhaltet.

PCR-Bedingungen: 35 Zyklen: 94°C 30 s; 60°C 30 s; 72°C 45 s.

3.2.1.2 Analyse der Expression von Insl6 an RNA aus verschiedenen Geweben der Maus

Für die Northern-Blot-Analyse wurde Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen der adulten Maus präpariert und 20 µg der jeweiligen RNA in einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde geblottet und mit der radioaktiv markierten Insl6-cDNA-Sonde (Abb. 3.13) hybridisiert.

Die Expression des Insl6-Gens konnte durch Hybridisierungssignale in einigen adulten Geweben nachgewiesen werden (Abb. 3.14.A). Das stärkste Signal konnte im Testis detektiert werden. In Niere, Ovar, Kolon und Milz konnten schwache Signale nachgewiesen werden. Eine anschließende Rehybridisierung des Northern-Blots mit einer cDNA-Sonde für β-Aktin diente zur Überprüfung der Integrität der RNA sowie zur Prüfung, ob gleiche Mengen an RNA eingesetzt wurden.

Zur Untersuchung des Insl6-Gens in verschiedenen Geweben wurde auch eine RT-PCR Analyse wie unter 3.2.1.1 durchgeführt. Wie aus der Abbildung 3.14.B entnommen werden kann, ist die Intensität der amplifizierten RT-PCR-Produkte im Testis höher als in anderen Geweben. Wie beim Northern-Blot konnte auch bei der RT-PCR Analyse keine Insl6-Expression in Gehirn, Herz, Lunge, Magen und Leber nachgewiesen werden.

A

B

Abb. 3.14: Analyse der Expression des Insl6-Gens der Maus in verschiedenen Geweben. (A) Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben wurde mit der Insl6-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Integrität und Menge der aufgetragenen RNA wurde durch eine Nachhybridisierung der Membran mit β-Aktin überprüft. (B) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zur Analyse der Expression in den verschiedenen Organen der Maus. Die Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen wurde einer RT-PCR mit Insl6-spezifischen Primern unterworfen. Die Integrität der RNA wurde durch eine zweite PCR mit Gapdh spezifischen Primern überprüft.

3.2.1.3 Expressionsanalyse von Insl6 durch RT-PCR an Gesamt-RNA der embryonalen Maus

Um Aufschluss über den Zeitpunkt der Expression des Insl6-Gens während der pränatalen Entwicklung zu erhalten, wurde eine RT-PCR an embryonaler Gesamt-RNA durchgeführt. Mit Insl6-spezifischen Primern wurde ein RT-PCR-Ansatz mit RNA aus

3.15). Das erwartete PCR-Produkt von 650 bp konnte in jedem Ansatz nachgewiesen werden. Daraus kann geschlossen werden, dass die Transkription des Insl6-Gens bereits sehr früh in der Embryonalentwicklung beginnt. Die Integrität der eingesetzten RNA wurde durch eine Kontroll-PCR mit Gapdh-spezifischen Primern überprüft.

Abb. 3.15: Expression von Insl6 während der Embryonalentwicklung der Maus. Für die Reverse-Transkriptase-Reaktion wurden RNA-Proben aus Embryonen der Entwicklungstage 9.5 bis 15.5 dpc (nach Befruchtung) verwendet. Die PCR-Produkte konnten durch die genspezifischen Primer Insl6-F2 und Insl6-R1 nach der Reversen-Transkriptase-Reaktion amplifiziert werden und wurden anschließend in einem 1.5%igen Agarosegel aufgetrennt. Das 650 bp große Fragment konnte in allen Ansätzen nachgewiesen werden. Eine Gapdh-Kontrolle diente zur Überprüfung der Integrität der RNA.

3.2.1.4 Untersuchungen zur Expression des Insl6-Gens während der Testisentwicklung

Zur Untersuchung der Expression des Insl6-Gens während der postnatalen Testisent-wicklung wurde Gesamt-RNA aus Testes von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 Tage alten Mäusen und auch aus adulten Mäusen präpariert. Die RNA wurde anschließend denaturierend gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert (Northern-Blot). Die Northern-Blot-Membran wurde anschließend mit dem radioaktiv markierten 0.65 kb langen Insl6-cDNA-Fragment üN bei 65°C hybridisiert.

Wie Abb. 3.16 zeigt, ist das 0.8 kb lange Insl6-Transkript erst ab Tag 15 der postnatalen Entwicklung detektierbar. An diesem Tag hat die Spermatogenese das Stadium der Pachytän-Spermatozyten erreicht. Zur Prüfung der Integrität der verwendeten RNA wurde die Membran mit der β-Aktin Sonde nachhybridisiert.

Abb. 3.16: Northern-Blot-Analyse zur Expression des Insl6-Gens der Maus in der postnatalen Testisentwicklung. Gesamt-RNA (je 20 µg) aus Testes 5, 10, 15, 20 und 25 Tage alter und adulter Mäuse wurde nach denaturierender Gelelektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der Insl6-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Integrität und Menge der aufgetragenen RNA wurde durch eine Nachhybridisierung der Membran mit β-Aktin überprüft.

3.2.1.5 Analyse der Expression des Insl6-Gens in Testes verschiedener Mausmutanten mit Keimzelldefekten

Für die Untersuchung der Expression von Insl6 im Testis verschiedener Mutanten der Maus wurden jeweils 20 µg Gesamt-RNA aus Testes der Mutanten W/W^v, Tfm/Y (Lyon und Hawkes, 1970), Insl3^-/- (Zimmermann et al., 1997), olt/olt (Moutier, 1976) und qk/qk (Bennett et al., 1971) gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der radioaktiv markierten 600 bp langen Insl6-cDNA hybridisiert (Abb. 3.17).

Abb. 3.17: Analyse der Expression des Insl6-Gens in Testes verschiedener Mausmutanten mit Keimzelldefekten. Gesamt-RNA (je 20 µg) aus Testes adulter Mäuse der Linien W/W^v, Tfm/Y, Insl3^-/-, olt/olt und qk/qk wurde nach denaturierender Gelelektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der Insl6-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Integrität und Menge der aufgetragenen RNA wurde durch eine Nachhybridisierung der Membran mit hEF-cDNA überprüft. Die starke Expression bei den Mutanten olt/olt sowie qk/qk, sowie die deutlich schwächere Expression in der Mauslinie Insl3^-/- ist gut zu erkennen.

Nach etwa einwöchiger Exposition konnten positive Hybridisierungssignale bei den Mäusen der Linien olt/olt und qk/qk nachgewiesen werden, bei der Insl3^-/--Mutante wurden geringe Insl6-Transkriptmengen detektiert. Bei der W/W^v- und Tfm/Y-Mutante konnte kein Insl6-Transkript gefunden werden (Abb. 3.17). Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass Insl6 erst in Pachytän-Spermatozyten exprimiert wird.

Im Testis der W/W^v-Mutante fehlen die Keimzellen. Bei der Tfm/Y-Maus differenzieren sich die Spermatogonien bis zu den Primärspermatozyten, während bei olt/olt- und qk/qk-Mutanten die Spermatogenese bis zu den haploiden Spermatiden erfolgt. Im Testis der kryptorchiden Mausmutante Insl3^-/- entwickeln sich die Spermatogonien aufgrund der abdominalen Temperatur um 37°C nur bis zu den diploiden Pachytän-Spermatozyten, jedoch können sich einige wenige Spermatogonien auch weiter ausdifferenzieren und die haploide Phase erreichen.