Expression des Insl5-Gens bei der Maus

3.1.1.1 Amplifikation der Insl5-cDNA der Maus mittels RT-PCR

Für die Herstellung einer Insl5 cDNA der Maus wurde die Methode der reversen PCR mit Insl5 spezifischen Oligonukleotiden gewählt.

Für die vorausgehende cDNA-Synthese wurden 1 µg Gesamt-RNA aus Thymus der Wildtyp-Mäuse revers transkribiert und einer PCR mit den genspezifischen Primern C-Insl5/F und C-Insl5/R RT-PCR unterzogen (2.2.7.7). Nach gelelektrophoretischer Auftrennung wies das amplifizierte RT-PCR-Produkt eine Länge von etwa 650 bp auf.

Nach der Klonierung in den Vektor pGEM-T Easy wurde das PCR-Produkte sequenziert. Durch Vergleich der Nukleotidsequenz des Klons mit der bereits bekannten Insl5-cDNA konnte eine Homologie von 100% zwischen den beiden Sequenzen festgestellt werden.

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ATG TAA

C-Insl5/R C-Insl5/F

Genomisch: >8.5 kb cDNA: 653 bp

Abb. 3.1: Schema und Primerpositionen für die durchgeführte RT-PCR. Die PCR wurde so geplant, dass das Produkt eine Länge von 653 bp hat und die Sequenz beider Exons beinhaltet. PCR-Bedingungen: 35 Zyklen: 94°C 30 s; 58°C 30 s; 72°C 45 s.

3.1.1.2 Untersuchung zur organspezifischen Expression des Insl5-Gens

Durch Northern-Blot Hybridisierungsexperimente sollte sowohl die Größe der mRNA für das Insl5-Gen der Maus als auch dessen organspezifische Transkription überprüft werden. Für die Expressionsanalyse in adulten Geweben wurden von jedem untersuchten Gewebe 20 µg Gesamt-RNA für einen Northern-Blot (2.2.5.3) eingesetzt.

Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C mit der radioaktiv markierten cDNA-Sonde (Abb.

3.1). Nach 16 stündiger Exposition des Autoradiogramms konnte ein Signal mit der Größe von 1 kb im distalen Kolon (Rektum) festgestellt werden (Abb. 3.2.A). Nach längerer Exposition (7 Tage) wurde ein schwaches Signal für ein kleineres Transkript im Thymus sichtbar (Abb. 3.2.B). Um die Integrität und Menge der untersuchten RNA zu überprüfen, wurde der Northern-Blot mit β-Aktin nachhybridisiert.

Um zu überprüfen, ob Insl5 auf niedrigem Level auch in anderen Geweben exprimiert wird, wurde die Expression des Insl5-Gens mittels RT-PCR analysiert. RNA wurde aus Gehirn, Thymus, Herz, Lunge, Niere, Milz, Magen, Leber, Kolon, Testis und Ovar adulter Mäuse extrahiert. 1 µg der so hergestellten RNA wurde revers transkribiert und nachfolgend einer PCR mit den genspezifischen Primern (Abb. 3.2.C) unterzogen. Von den PCR-Ansätzen wurden 10 µl in einem 1.5%igem Agarosegel aufgetrennt.

A B

C

Abb. 3.2: Analyse der Expression des Insl5-Gens der Maus in verschiedenen Geweben. (A, B) Gesamt-RNA (je 20 µg) aus verschiedenen Geweben wurde nach denaturierender Gelelektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der Insl5-cDNA-Sonde (Abb. 3.1) hybridisiert. Die Integrität und Menge der aufgetragenen RNA wurde durch eine Nachhybridisierung der Membran mit β-Aktin überprüft. (A) Die Expressionszeit des Autoradiogramms betrug 16 Stunden, (B) nach 7 Tagen. (C) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zur Analyse der Expression in den verschiedenen Organen der Maus. Die Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen wurde einer RT-PCR mit Insl5-spezifischen Primern unterworfen. Die Integrität der RNA wurde durch eine zweite PCR mit Gapdh spezifischen Primern überprüft.

Wie in Abb. 3.2.C zu sehen ist, konnten in einigen Organen Transkripte von Insl5 nachgewiesen werden. Die Integrität der verwendeten RNA wurde nachfolgend durch die Amplifikation der Gapdh-mRNA überprüft.

3.1.1.3 Expressionsanalyse von Insl5 während der Embryonalentwicklung der Maus

Um Aufschluss über den Zeitpunkt der Expression des Insl5-Gens während der pränatalen Entwicklung zu erhalten, wurden eine Northern-Blot und eine RT-PCR

Für diese Analyse wurden Mäuseembryonen zwischen Tag 8.5 und 17.5 der Schwangerschaft präpariert. Die Bestimmung der jeweiligen Tage der Schwangerschaft erfolgte durch die Kontrolle des Vaginalpfropfes (VP) am Morgen nach natürlicher Verpaarung. Nach Extraktion der Gesamt-RNA wurden jeweils 20 µg der RNA in einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde geblottet und mit der radioaktiv markierten cDNA-Sonde hybridisiert. Es konnten keine Insl5-Transkripte während der Embryonalentwicklung nachgewiesen werden (Abb. 3.3.A).

Die Integrität der eingesetzten RNA wurde durch Nachhybridisierung der Membran mit β-Aktin überprüft.

Mit Insl5-spezifischen Primern wurde ein RT-PCR-Ansatz mit RNA aus 9.5 bis 17.5 Tage alten Embryonen durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf ein Agarosegel gegeben und elektrophoretisch aufgetrennt (Abb.3.3.B). Das erwartete PCR-Produkt von 653 bp konnte erstmal bei 11.5 Tage alten Mäuseembryonen nachgewiesen werden. Daraus kann geschlossen werden, dass die Transkription von Insl5 bereits sehr früh in der Embryonalentwicklung beginnt. Die Integrität der eingesetzten RNA wurde durch eine Kontroll-PCR mit Gapdh-spezifischen Primern überprüft.

A

B

Abb. 3.3: Analyse der Expression des Insl5-Gens der Maus während der Embryonalentwicklung (A) Gesamt-RNA (je 20 µg) aus ganzen Embryonen zwischen den Tagen 8.5 und 17.5 wurde nach denaturierender Gelelektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit der Insl5-cDNA-Sonde hybridisiert. (B) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zur Analyse der Expression des Gens in Mausembryonen. Die aufgereinigten Extrakte wurden für eine RT-PCR mit Insl5-spezifischen Primern herangezogen. Die Integrität der RNA wurde durch eine zweite PCR mit Gapdh-spezifischen Primern überprüft. kb= 1kb Leiter, K=Leerkontrolle.

3.1.1.4 Untersuchung zur Expression des Insl5-Gens der Maus in postnatalen Testes und bei verschiedenen Mausmutanten mit Keimzelldefekten

Zur Untersuchung der Expression des Insl5-Gens während der postnatalen Testis-Entwicklung wurden RT-PCR-Analysen an RNA aus Wildtyptestis sowie aus Testes der Mutanten W/W^v, Tfm/Y, Insl3^-/-, olt/olt und qk/qk durchgeführt. Nach der Auftrennung der PCR-Produkte auf dem Agarosegel konnte das Insl5-Transkript in allen postnatalen Testis-Stadien nachgewiesen werden. Die Intensität des Insl5 steigt nach drei Wochen an (Abb. 3.4.A). Bei allen getesteten Mausmutanten ist das Insl5-Transkript nachweisbar (Abb. 3.4.B).

Es wurde dann überprüft, ob die Insl5-Expression auf Keimzellen beschränkt ist. RT-PCR-Analysen wurden mit RNA aus Testis, Ovar, einer Leydig-Zelllinie (MA10), einer Sertoli-Zelllinie (P15) und embryonalen Stammzellen (ES) durchgeführt. In der Leydig-Zelllinie (MA10), der Sertoli-Leydig-Zelllinie (P15) und in den ES-Zellen waren keine Insl5-Transkripte detektierbar (Abb. 3.4.C).

A

B C

Abb. 3.4: Analyse der Expression des Insl5-Gens in der postnatalen Testisentwickliung, in verschiedenen Mausmutanten mit Keimzelldefekten und in verschiedenen Zelllinien. RT-PCR mit