2.4.1 Bestimmung der Formiat-Dehydrogenase-Aktivität
Während der Aufreinigung der Formiat-Dehydrogenase wurde die Aktivität durch die Oxidation von Formiat (WAGNER UND ANDREESEN 1977, mod.) bestimmt.
Messung der Formiat-Dehydrogenase-Aktivität in Glasküvetten
Der Enzymtest wurde unter strikt anaeroben Bedingungen in Halbmikroglasküvetten (d=1 cm, Ochs Labortechnik, Bovenden), die nach dem Einfüllen von Testpuffer, Benzylviologen und anschließender Begasung mit Stickstoff mit Naturkautschuk-Septen (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) verschlossen wurden.
Die Reduktion von Benzylviologen wurde bei 578 nm an einem UV-1202-Photometer (Shimadzu, Jena) mit „Kinetik“-Programmkarte verfolgt.
Testansatz: Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 8,0) 920 µl
Benzylviologen (0,25 M)1 20 µl
Natrium-Dithionit (50 mM)1 2 - 3 µl
Enzymprobe 0,25 - 5 µl
Formiat (0,4 M)1 50 µl
1 Die Lösungen wurden in abgekochtem Testpuffer angesetzt. In den Messungen zum Vergleich der spe-zifischen Aktivität von Formiat-Oxidation und CO2-Reduktion wurden 15 µl einer 0,4 M-Stammlösung Methylviologen eingesetzt.
Die Anfangsextinktion wurde mit Natrium-Dithionit auf ca. 0,3 eingestellt, um Restsauerstoff aus der Küvette zu entfernen. Der Enzymtest wurde bei 34 °C durchgeführt. Der Ansatz wurde bis zu 2 min ohne
2. MATERIAL UND METHODEN 26
Substrat bei 34 °C inkubiert, um die Blindreaktion abklingen zu lassen. Anschließend wurde die Blindre-aktion gemessen; nach Substratzugabe erfolgte die Messung der ReBlindre-aktion (20 s je Messung). Aus der durch das Programm berechneten Extinktionsänderung pro Minute konnte die Volumenaktivität der Pro-be Pro-berechnet werden:
P T
v d v
V A E
⋅
⋅
⋅
= ∆
ε
min /Av = Volumenaktivität [U/ml] (1 U entspricht Umsatz von 1 µmol Substrat pro min)
∆E/min = Extinktionsänderung pro Minute [min-1] d = Schichtdicke [cm]
ε = Extinktionskoeffizient [mM-1cm-1] ε578 (Benzylviologen) = 8,3 mM-1cm-1 ε600 (Methylviologen) = 13,1 mM-1cm-1 VT = Volumen des Testansatzes [ml]
vP = Volumen der Probe [ml]
Bei der Berechnung ist zu beachten, dass Benzyl- und Methylviologen Einelektronenüberträger sind, d. h. zwei Viologen-Moleküle pro umgesetztes Formiat-Molekül reduziert werden.
Messung der Formiat-Dehydrogenase-Aktivität mittels Mikrotiterplattentest
Zur schnelleren Detektion von Enzymaktivitäten während der Aufreinigung konnte der Enzymtest auch in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Während der ersten Anreicherung wurde Methylenblau als Elektronenakzeptor verwendet, während der zweiten Benzylviologen. Eine in die Anaerobenbox eingeschleuste Mikrotiterplatte wurde vorbereitet, indem jeweils 150 µl Testmix (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 mM Methylenblau/5 mM Benzylviologen, 20 mM Formiat) vorgelegt wurden. Zur Bestimmung der Blindreaktion diente ein zweiter Testmix ohne Substrat. Von jeder zweiten bis fünften Fraktion wurden 1 - 5 µl Probe in Testmix mit und ohne Substrat pipettiert. Anschließend wurden die Fraktionen ausgewählt, die am schnellsten zu einer Entfärbung des Ansatzes führten. Die Quantifizierung erfolgte danach im Küvettentest.
Bestimmung der Aktivität der Formiat-Dehydrogenase als CO2-Reduktase
Die allgemeinen Bedingungen waren analog der Aktivitätsmessung durch Formiat-Oxidation. Zum Nachweis der CO2-Reduktase-Aktivität der Formiat-Dehydrogenase wurde der folgende Ansatz gewählt:
Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 8,0) 860 µl
Methylviologen (10 mM) 15 µl
DTT (0,5 M) 20 µl
Der Testansatz wurde 5 min inkubiert, anschließend wurden die folgenden Reagenzien zugefügt:
Natrium-Dithionit (50 mM)1 2 - 3 µl
NaHCO3 (0,3 M in 0,3 M KP, pH 7,2) 100 µl
Enzymprobe 1 - 5 µl
2. MATERIAL UND METHODEN 27
Die Dithionitzugabe wurde so gewählt, dass sich durch das reduzierte Methylviologen eine Extinktion von ca. 1 ergab. Nach Messung der Blindreaktion nach Zugabe von Dithionit und Substrat, wurde die Reaktion durch die Zugabe des Enzyms gestartet und die Abnahme der Extinktion bei 578 nm verfolgt.
Die Tests wurden mit der MonoQ-Fraktion 30 durchgeführt, pro µl waren ca. 0,1 U FDH-II enthalten (durch Formiat-Oxidation mit Methylviologen als Elektronenakzeptor bestimmt). Einige Tests wurden in Gegenwart von 10 µl Carboanhydrase-Lösung (50 U/µl) durchgeführt.
2.4.2 Voraussetzungen für die Anreicherung Sauerstoff-empfindlicher Proteine
Alle im folgenden beschriebenen Methoden zur Aufreinigung der Formiat-Dehydrogenase aus E. acida-minophilum mussten unter strikt anaeroben Bedingungen erfolgen. Dazu wurden alle Schritte in einer Anaeroben-Box (Coy Laboratories Inc., Vertrieb durch Toepffer, Adelberg) unter einer Formiergasatmo-sphäre (5 % H2 / 95 % N2) bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle verwendeten Puffer wurden ausge-kocht und unter Stickstoffbegasung abgekühlt und anschließend in Schraubverschlussflaschen (Müller und Krempel, Zürich, Schweiz) mit Latex-Gummisepten (Maag, Dübendorf) abgefüllt. Fraktionen, die während der Anreicherung aus der Anaeroben-Box ausgeschleust werden mussten, wurden vorher in Hungate-Röhrchen oder Serumflaschen mit Septen überführt. Alle Geräte und Kunststoffgefäße wurden mindestens einen Tag vor der Benutzung in die Anaeroben-Box eingeschleust. Falls eine Lagerung von Fraktionen über Nacht oder mehrere Tage notwendig war, wurden diese bei –20 °C eingefroren.
2.4.3 Puffer für die Anreicherung der Formiat-Dehydrogenase
Soweit nicht anders erwähnt, wurden für die Anreicherung stets die folgenden Puffer verwendet:
Puffer A: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
10 mM Natrium-Azid 2 mM DTT
2 mM Na2S2O4
0,1 µg/l Resazurin
Puffer B: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
10 mM Natrium-Azid 2 mM DTT
0,1 µg/l Resazurin
Puffer C: Puffer A mit 1 M NaCl
2. MATERIAL UND METHODEN 28
2.4.4 Fällungen
Ammoniumsulfat-Fällung
Die fraktionierte Fällung erfolgte mit Hilfe einer bei 4 °C gesättigten Ammoniumsulfatlösung. Dazu wurde 4 M (NH4)2SO4 in Puffer A eingewogen, wobei sich das Ammoniumsulfat nicht vollständig löste.
Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf 8,0 eingestellt. Die Lösung wurde vor ihrer Verwendung minde-stens 1 h gerührt, um Sättigung zu erreichen. Mit dieser Lösung wurde durch tropfenweise Zugabe die gewünschten Konzentrationen in der Probe eingestellt. Die Berechnung erfolgte in % (v/v), was ungefähr mit % Sättigung übereinstimmen müsste. Die Probe wurde anschließend 30 min gerührt und danach zen-trifugiert. Die fraktionierte Fällung der ersten Anreicherung wurde bei 4 °C, die der zweiten bei Raum-temperatur durchgeführt.
Hitzefällung
Für die Vortests wurde der zuvor auf Eis gelagerte Rohextrakt (0,5 ml) in Hungate-Röhrchen im Was-serbad 3 bzw. 10 min bei 50 - 70 °C schüttelnd inkubiert und anschließend sofort in Eiswasser abgekühlt.
Ausgefallenes Protein wurde durch Zentrifugation der Hungate-Röhrchen in der Eppendorf-Zentrifuge bei 3.500 rpm, 4 °C, 10 min pelletiert. Anschließend wurde die FDH-Aktivität im Überstand bestimmt.
Während der zweiten Anreicherung wurde eine Hitzefällung bei 60 °C für 10 min durchgeführt. Der Rohextrakt wurde auf Hungate-Röhrchen verteilt (10 ml pro Röhrchen) und vor und nach der Hitzeein-wirkung auf Eis inkubiert. Das denaturierte Protein wurde durch Zentrifugation abgetrennt, die Röhrchen wurden 20 min bei 4 °C bei 3.500 rpm (Hermle Z323K, Hermle Labortechnik, Wehingen) zentrifugiert und in die Anaerobenbox geschleust. Die Überstände wurden vereinigt und noch einmal bei 20.000 rpm in SS34-Röhrchen zentrifugiert.
2.4.5 Säulenchromatographie
Abgesehen von den Vorversuchen wurden alle säulenchromatographischen Schritte an einer FPLC-Anlage, bestehend aus Pumpe P-500, der UV-Einheit Optical Unit UV1 und einem Fraktionssammler FRAC-100 mit angeschlossenem Schreiber REC 101 (alles Amersham-Pharmacia, Freiburg) in einer Anaerobenbox bei Raumtemperatur durchgeführt.
Vorversuche
Um die Bindungsfähigkeit der Formiat-Dehydrogenase an unterschiedlichen Säulenmaterialien zu testen, wurden verschiedene Probesäulen mit einem Bettvolumen von 1-2 ml verwendet. Die verwendeten Ma-terialien wurden entsprechend den Herstellerangaben reaktiviert und gelagert und sind in Tabelle 4
auf-2. MATERIAL UND METHODEN 29
gelistet. Als Extrakt von E. acidaminophilum diente die Fraktion von 0-60 % der Ammoniumsulfat-Fällung.
Tabelle 4: Säulenmaterialien für Vorversuche
Gelmaterial Äquilibrierungspuffer Elutionspuffer
Phenyl-Sepharose1 Hexyl- Sepharose2 Octyl- Sepharose2 Decyl- Sepharose2 Docecyl-Sepharose2
1 M (NH4)2 SO4 in Puffer A Puffer A
Reactive Red2 Reactive Blue 42 Reactive Blue 722 Reactive Brown 102 Cibacron Blue2
Puffer A Puffer C
1 Amersham-Pharmacia, Freiburg
2 Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Anreicherung der Formiat-Dehydrogenase
Für die Anreicherung der Formiat-Dehydrogenase wurden folgende chromatographischen Schritte durchgeführt:
• Anionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose Fast Flow
• Hydrophobe Interaktions-Chromatographie an Octyl-Sepharose
• Anionenaustauschchromatographie an MonoQ HR5/5
• Gelfiltration an einer Superdex 200 HR 10/30 Fertigsäule (nur bei der 1. Anreicherung)
Alle Materialien bzw. Säulen waren von Amersham-Pharmacia (Freiburg) und wurden nach Angaben des Herstellers benutzt und regeneriert. Zur ausführlicheren Beschreibung der Anreicherung s. 3.4.
2. MATERIAL UND METHODEN 30