Überexpression von FdhA1 in E. coli

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 59

Weitere Untersuchungen müssten zeigen, ob die Formiat-Dehydrogenase und AOR/CAR von C. stick-landii Wolfram- oder Molybdän-abhängig sind. Im Falle der AOR/CAR handelt es sich vermutlich um ein Wolfram-abhängiges Protein, da bisher noch kein Molybdän-abhängiges Isoenzym dieser Sequenz-familie bekannt ist.

Die Abhängigkeit des Wachstums von C. sticklandii von der Supplementierung von Wolframat oder auch Molybdat ist bisher nicht belegt. Andererseits lassen solche Experimente aber auch nur dann ein-deutige Aussagen zu, wenn das Ergebnis die Abhängigkeit des Organismus von dem untersuchten Stoff zeigt. So konnte für E. acidaminophilum eine Abhängigkeit von Selen nur bei Wachstum auf Glycin, Betain und Sarkosin gezeigt werden, was nahelegte, dass an der Glycin-, Betain- und Sarkosin-Reduktion mindestens ein Selenoprotein beteiligt ist, nicht aber bei Wachstum auf Serin (ZINDEL et al.

1988). Ein falscher Schluss wäre in diesem Fall, davon auszugehen, dass beim Wachstum auf Serin keine Selenoproteine exprimiert werden. Wie in dieser Arbeit gezeigt, wird auf Serin im Vergleich zu Glycin die Expression der zweiten ebenfalls Selen-haltigen Formiat-Dehydrogenase sogar um den Faktor 100 verstärkt (s. 3.1.9). Eine mögliche Erklärung dafür, dass trotzdem keine Abhängigkeit von Selen-Supplementation festgestellt werden konnte, liegt in dem wesentlich geringeren Anteil der Formiat-Dehydrogenase am Gesamtproteingehalt im Vergleich zu den Reduktasesystemen begründet. Dies wird auch dadurch deutlich, dass bei Markierungsexperimenten mit radioaktivem Selen durch WAGNER

(1997) neben den bereits bekannten, an den Reduktasen beteiligten Selenoproteinen Protein A und der spezifischen Untereinheiten der Substrat-spezifischen Proteine B noch weitere markierte Proteine ent-deckt wurden, ein den Formiat-Dehydrogenasen entsprechendes Signal fehlte jedoch.

Aussagekräftige Ergebnisse bezüglich des Metallgehalts der Formiat-Dehydrogenase und AOR/CAR aus C. sticklandii wären daher durch eine Charakterisierung der homogenen Enzyme zu erreichen.

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 60

in deren mRNAs sich keine ähnlichen Sekundärstrukturen finden lassen. KLUG et al. (1997) identifizier-ten die essentiellen Bestandteile der Sekundärstruktur von fdhF, die in Abb. 3.10 grau unterlegt sind.

Alle als notwendig gefundenen Basen sind auch in der Sekundärstruktur von fdhA1 vorhanden, allerdings ist der Loop um ein U länger, und das bei fdhF ungepaarte U im Stamm liegt bei fdhA1 gepaart vor.

Aus diesem Grund wurde sowohl das Wildtyp-FdhA1 als auch eine Secys-350-Cys-Mutante exprimiert.

G-U G U C

G C G U

A-U A-U

C-G C-G

G-C G-C

U-A U-A

U U-A

G-C G-C

G-C U-A A C

C A C A

U-A A-U U C

A-U C-G

C C C-G

C-G U-A

C-G U-A

G U C-G

G-C G-C

C-G U G

A A G

C-G C T

UGA UAA UGA GCT

(1) fdhF (2) fdhA1

Abb. 3.10: Vergleich der Sekundärstrukturen direkt stromabwärts des UGA-Codons von (1) fdhF (E. coli) und (2) fdhA1 (E. acidaminophilum). Nach KLUG et al. (1997) für die Bindung von SelB essentielle Basen im Loopbereich sind grau unterlegt.

Die Expression aktiven Proteins war von Anfang an sehr unwahrscheinlich. Selbst wenn FdhA1 als Se-lenoprotein exprimiert würde, müssten noch ausreichende Mengen des Cofaktors Molybdopterin synthe-tisiert und eingebaut werden. Da E. coli keine Wolfram-Enzyme besitzt, würde statt des Wolframs vermutlich Molybdän eingebaut. Auch dass die Synthese der Eisen-Schwefel-Zentren ohne Schwierig-keiten ablaufen würde, war eher unwahrscheinlich.

3.3.1 Expression von FdhB1 und FdhA1 mit dem IMPACT-System

Für die heterologe Expression von FdhA1 und FdhB1 in E. coli wurde zunächst das IMPACT™ T7:One-Step Protein Purfication System von NEW ENGLAND BioLabs gewählt. Dabei wird das gewünschte Protein an einen Fusionspartner fusioniert, der aus einem selbst-spleißenden Intein und einer

Chitin-3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 61

Bindedomäne besteht. Nach Bindung des exprimierten Fusionsproteins an eine Chitin-Matrix wird das Target-Protein nach der in vitro-Spaltung der Fusionspartner eluiert.

Die Expressionsbedingungen wurden zunächst für die Cystein-Mutante von FdhA1 und FdhB1 unter-sucht. Die Mutation des Selenocysteins zu Cystein wurde mit Hilfe der overlap-extension PCR einge-führt. Als Primerpaare wurden zunächst fdhA1-NdeI mit U/C-f und fdhA1-SalI mit M-fdhA1-U/C-r kombiniert. Die aus chromosomaler DNA von E. acidaminophilum amplifizierten Produkte wur-den dann als Template in einer zweiten PCR eingesetzt, in der nur fdhA1-NdeI und fdhA1-SalI eingesetzt wurden. Das erhaltene PCR-Produkt wurde in den Überexpressionsvektor pTYB2 kloniert und zur Kon-trolle sequenziert. Für die Amplifikation von fdhB1 kamen die Primer fdhB1-NdeI und fdhB1-XhoI zum Einsatz. Die resultierenden Plasmide pFdhA1-Impact und pFdhB1-Impact wurden in den E. coli Überex-pressionsstamm ER2566 transformiert und die Expressionshauptkulturen direkt von einer Einzelkolonie angeimpft. Trotz Variation der Expressionsbedingungen konnte zunächst weder FdhA1 noch FdhB1 rekombinant nachgewiesen werden. Da FdhB1 theoretisch leichter exprimierbar sein sollte, da es kleiner ist und als einziges Expressionhindernis nur die Eisen-Schwefel-Zentren aufweist, wurden die Bedin-gungen zunächst für die Expression von FdhB1 optimiert. Es zeigte sich, dass Expressionsprodukte nur nachweisbar waren, wenn die in E. coli seltene tRNA für die Arginin-Codons AGG und AGA, die E. acidaminophilum im Gegensatz zu E. coli überwiegend verwendet (s. 3.1.7), coexprimiert wurde. Dies wurde durch ein zweites mit dem Expressionsvektor kompatibles Plasmid pUBS520 (BRINKMANN 1990) erreicht. Allerdings spaltete sich das FdhB1-Fusionsprodukt bereits in vivo, wodurch eine Aufreinigung nicht mehr möglich war. Bei Coexpression der Arginin-tRNA ließ sich das FdhA1-Expressionsprodukt (Cystein-Mutante) ungespaltet exprimieren, jedoch lag das Protein in inclusion bodies vor, was eine Auf-reinigung gleichfalls unmöglich machte.

3.3.2 Expression von FdhA1 als Strep-tagII-Fusion

Mit den pASK-IBA-Expressionsvektoren können rekombinante Proteine exprimiert und durch das Strep-tagII-System effizient gereinigt werden. Durch Klonierung des gewünschten Gens in pASK-IBA7 ist das Protein nach Expression mit einem N-terminalen Strep-tagII versehen, der auch wieder abgespalten wer-den kann. Durch Verwendung des Restriktionsenzyms BsaI, das nicht innerhalb der Erkennungssequenz schneidet, kommt es zu einer gerichteten Klonierung trotz der Verwendung nur eines Enzyms, auch weitere Erkennungssequenzen in der Strukturgensequenz schaden nicht, da die entstehenden Enden der verschiedenen Schnittstellen nicht kompatibel sind. Da Proteine mit einer Strep-tag-Fusion auch denatu-rierend gereinigt werden können, bot sich dieses System für die Expression von FdhA1 an.

Das fdhA1-Gen wurde mit den Primern fdhA1-BsaI-N und fdhA1-BsaI-C aus chromosomaler DNA am-plifiziert. Für die Konstruktion der Cystein-Mutante kamen die gleichen Primer zum Einsatz, als Tem-plate diente pFdhA1-Impact (s. 3.3.1). Zusätzlich zu diesen beiden Varianten wurden N-terminal

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 62

verkürzte Konstrukte von FdhA1 hergestellt, die erst bei Aminosäure 218 mit Methionin statt Threonin beginnen. Dadurch werden die ersten vier Bindemotive für Eisen-Schwefel-Zentren (C1-C4) deletiert, die Polypeptidkette weist die gleiche Länge und alle Motive ab C5 wie die Formiat-Dehydrogenasen kürzeren Typs auf (s. 3.1.3). Als N-terminaler Primer wurde fdhA1-BsaI-∆N in Kombination mit fdhA1-BsaI-C eingesetzt, als Template dienten wiederum chromosomale DNA und pFdhA1-Impact. Die erhal-tenen PCR-Produkte wurde in den Überexpressionsvektor pASK-IBA7 kloniert und zur Kontrolle se-quenziert. Zur Expression wurden die Plasmide in den Expressionsstamm E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL transformiert. Dieser Stamm ist für die Expression von Proteinen konstruiert wor-den, deren Codonnutzung von der von E. coli abweicht und exprimiert zusätzlich nicht nur die tRNA für die Arginin-Codons AGG/AGA, sondern auch die tRNAs für die Leucin-Codons UUA/UUG (die E.

acidaminophilum aber auch nur selten verwendet) und für das Isoleucin-Codon AUA, das von E. acid-aminophilum zu 75 % verwendet wird. Zunächst wurden pro Variante eine 50 ml-Kultur mit einer Ein-zelkolonie angeimpft, bei 30 °C inkubiert und bei einer optischen Dichte von 0,5 mit 0,2 µg/ml AHT induziert. Die Zellen wurden mittels French-Presse aufgeschlossen und durch Zentrifugation in Pellet und Überstand getrennt. Aliquots aller Proben wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese un-terworfen und geblottet. Die Strep-tagII-Fusionsproteine wurden mit dem „Strep-tag detection Assay“

nachgewiesen (Abb. 3.11).

Abb. 3.11: Nachweis der Überexpression verschiedener FdhA1-Varianten mittels Western-Blot. Zellextrakte wurden nach dem Zellaufschluss durch Zentrifugation in lösliche (Überstand, Ü) und unlösliche Bestandteile (Pel-let, P) getrennt. Zur Herstellung des Western Blots und Nachweis der Strep-tag-Fusionsprotein siehe Text. Die Größe der exprimierten Varianten (in kDa) ist links angegeben. Eine 2. Markerspur (M) wurde nach dem Blotten abgeschnitten und angefärbt. Die Größen der Standardproteine (in kDa) sind am rechten Rand angegeben. Die Pro-teine des prestained-Molekulargewichtsmarkers (M*), der auf dem Blot zu sehen ist, laufen durch die kovalente Bindung des Farbstoffs langsamer als ihrem Molekulargewicht entsprechend. Das lösliche Biotin-Carrier-Protein (BCP) von E. coli, das bei ca. 20 kDa läuft, reagiert ebenfalls positiv auf den Strep-tag-Antikörper-Nachweis.

FdhA1

FdhA1-U/C

∆N-FdhA1

∆N-FdhA1-U/C

∆N-FdhA1-U/C

P Ü P Ü P Ü P M* Ü

38,5 98,0 73,8

14,3 BCP

M

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 63

In allen vier Ansätzen konnte exprimiertes Fusionsprotein nachgewiesen werden. Die Varianten Wild-typ-FdhA1 (in voller Länge) und ∆N-FdhA1 (N-terminal verkürzt) wurden nur verkürzt exprimiert, die detektierten Größen korrelieren mit einem Abbruch am TGA-Codon, während die entsprechenden Cy-stein-Mutanten FdhA1-U/C und ∆N-FdhA1-U/C Proteine lieferten, die Signale ergaben, die mit den für das komplette Protein errechneten Größen übereinstimmen. Als Teilergebnis läßt sich daher festhalten, dass auch die Sekundärstruktur der mRNA von fdhA1 von E. acidaminophilum für die Inkorporation von Selenocystein in E. coli nicht ausreichend konserviert ist.

Nur im Falle der Variante ∆N-FdhA1-U/C wurde ein geringer Teil des Proteins löslich exprimiert und konnte mittels Affinitätschromatographie an StrepTactin gereinigt werden. Da das Protein elektrophore-tisch noch nicht ganz homogen war, wurde eine Ionenaustauschchromatographie an MonoQ angeschlos-sen. Das Protein eluierte nicht in einem Peak, sondern war in der Hälfte aller Fraktionen enthalten, was als Anzeichen dafür gewertet werden kann, dass auch das löslich exprimierte ∆N-FdhA1-U/C nicht kor-rekt gefaltet vorliegt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass auch FdhA1 in E. coli nicht als Selenoprotein expri-miert werden kann. Jedoch könnte überexpriexpri-miertes Protein zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet werden. Dazu sollte Variante ∆N-FdhA1-U/C gewählt werden, da bei dem Einsatz von Anti-körpern gegen dieses Protein keine zusätzlichen Kreuzreaktionen gegen FdhB1 und FdhB2 auftreten sollten. Für die Immunisierung eines Kaninchens werden größere Mengen homogenen Proteins (ca.

1 mg) benötigt. Daher bietet sich eine denaturierende Aufreinigung des unlöslich exprimiertes ∆ N-FdhA1-U/C-Proteins an.